miR-217通過靶向14-3-3ν抑制胃癌轉移的作用及機制研究*

雷微　鄧明明

(四川醫科大學附屬第一醫院消化科, 四川 瀘州 646000)

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·論著·

miR-217通過靶向14-3-3ν抑制胃癌轉移的作用及機制研究*

雷微鄧明明

(四川醫科大學附屬第一醫院消化科, 四川 瀘州 646000)

【摘要】目的探討miRNA-217(miR-217)抑制胃癌細胞轉移的作用及其機制。方法qRT-PCR法比較胃癌組織、癌旁組織、胃癌細胞系和正常胃上皮細胞中miR-217的表達差異。轉染miR-217 mimics或Inhibitors后，通過Transwell侵襲實驗觀察miR-217的胃癌細胞轉移能力的影響；建立裸鼠尾靜脈轉移模型，觀察穩定表達miR-217在體內對胃癌轉移能力的影響；生物信息學分析miR-217的候選靶基因為14-3-3ν，熒光素酶報告基因實驗檢測SGC7901細胞中miR-217過表達對野生型和突變型14-3-3ν熒光素酶活性的影響。Western blot檢測miR-217對14-3-3ν野生型和突變體蛋白表達的影響。結果miR-217在胃癌組織中的表達明顯低于癌旁組織(P<0.01)；在各胃癌細胞中的表達量較正常胃上皮細胞GES顯著降低(P<0.01)。miR-217 mimics抑制SGC7901細胞的侵襲能力，與陰性對照的差異有統計學意義(P<0.01)。而miR-217 inhibitors明顯促進SGC7901細胞的侵襲能力(P<0.01)；體內實驗發現穩定過表達miR-217的SGC7901細胞轉移能力明顯降低。熒光素酶報告基因結果證實miR-217能夠抑制14-3-3ν的3′-UTR區熒光素酶活性；Western blot結果顯示轉染miR-217后，SGC7901細胞中的14-3-3ν蛋白水平明顯低于對照組；Western blotting結果顯示miR-217過表達顯著抑制14-3-3ν-wt，而不能抑制14-3-3ν-mut的蛋白表達。結論miR-217能夠通過靶向14-3-3ν抑制胃癌轉移，促進miR-217的表達或抑制14-3-3ν的表達可能是抑制胃癌轉移的有效手段。

【關鍵詞】胃癌；轉移；微小RNA；微小RNA-217；14-3-3ν

胃癌是我國的主要惡性腫瘤之一，占腫瘤相關死亡人數占42.5%，是各類癌癥死亡率的第三位[1]。大多數患者發現胃癌時已發生臨近器官或者遠處轉移，成為胃癌患者的主要死因。微小RNA(miRNA，miR)，即20-24個核苷酸的是近年來發現的一類通過與靶基因的mRNA發生特異性結合而發揮轉錄后負性調控作用的非編碼小RNA[2]。多種miRNA已被證實通過調控下游靶基因，在胃癌侵襲和轉移惡性生物學行為中發揮關鍵作用[3, 4]。有研究發現miR-217能夠靶向KRAS抑制胰腺癌生長[5]，miR-217還能夠靶向E2F3抑制肝癌轉移[6]。然而，miR-217在胃癌中的作用尚不清楚。本研究通過探索miR-217在胃癌轉移過程中的作用及其分子機制，為抑制胃癌轉移提供新的有效治療靶點。

1材料與方法

1.1標本與細胞收集2014年3月～6月我院普通外科胃癌組織和對應正常組織標本各20例。其中男14例，女6例；年齡36～63歲，中位年齡53歲。胃癌標本、對應正常組織均得到病理證實。胃永生化正常上皮細胞GES，胃癌細胞AGS、MKN28、SGC7901、BGC823、MKN45均保存于我院。

1.2實驗耗材RPMI-1640、胎牛血清均購自美國Gibco公司。miR-217 mimics 和inhibitor均購自廣州銳博生物科技有限公司。Dual-luciferase檢測試劑盒購自美國Pormega公司。Transwell培養小室購于Corning公司。鼠抗人β-actin單克隆抗體購于Sigma公司，兔抗人14-3-3ν抗體購于Cell signaling公司。

1.3方法

1.3.1細胞轉染取正常生長的SGC7901細胞，消化后重新接種到相應的6孔板，培養24 h后進行轉染。利用脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000并參照其轉染步驟將NC或miR-217 mimics或inhibitors轉染到SGC7901細胞中，終濃度為100 nmol/L，轉染6 h后更換為完全培養基。

1.3.2RNA提取和qRT-PCR細胞經過不同處理后，加入TRIzol充分裂解。每1 ml TRIzol加入0.3 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置15 min，4℃下12000 g離心15 min，小心轉移上層水相至新EP管中，加入05 ml異丙醇后混勻，4℃下12000 g離心20 min，棄上清，加入 1 ml 75 % 乙醇，洗滌RNA沉淀，4℃下12000 g 離心5 min；加入適量DEPC水溶解后于-80℃保存備用。反轉錄和qRT-PCR引物均購自廣州銳博公司。qRT-PCR采用莖環法SYBR green PCR mix(Takara)對miRNA進行定量分析，所有反應在8聯管中進行，擴增反應采用三復孔；反應體系為20 μl，包含SYBR Green PCR Master Mixture試劑10 μl，cDNA模版2 μl，上下游引物各0.8 μl，去離子水H2O 6.4 μl；擴增程序：95℃，15 s；60 ℃，30 s；70 ℃，15 s，40個循環；U6為內參。

1.3.3靶基因預測 使用Targetscan，PicTar，miranda等miRNA靶基因數據庫共同預測，對靶基因3′-UTR區與miR-217種子序列進行堿基互補比對并計算結合穩定性，同時檢查該基因的miR-217結合區域是否具有保守型。

1.3.4雙熒光素酶報告基因實驗與驗證構建野生型全長14-3-3ν的3′UTR的質粒，并通過定點突變技術構建突變型載體。將NC或miR-217以及14-3-3ν-wt或14-3-3ν-mut載體共轉到胃癌細胞中。轉染48 h后，每孔加入1 X PLB裂解液100 μl，裂解15 min，將裂解液轉移到1.5 ml的EP管中， 4℃下10000 g離心5 min。轉移上清到新的EP管中待測。在EP管中加入LAR 底物40 μl，加入10 μl稀釋的上清，酶標儀讀取Renilla熒光素酶的熒光值。加入終止試劑40 μl，立即讀取firefly熒光素酶熒光值。用比值計算各樣本熒光強度。

1.3.5Transwell實驗將轉染NC或miR-217 48 h后的SGC7901細胞消化計數，并用無血清的培養基重懸， 分別接種到平衡后的Insert小室中，下室的24孔板中加入含有10% FBS的培養基，37℃ 下培養24 h后取出。擦除未穿孔的上室細胞、甲醇固定15 min后0.1%結晶紫染色40 min，顯微鏡下觀察并計數。

1.3.6Western blotting法檢測轉移和凋亡相關蛋白表達細胞經過不同處理后，提取總蛋白，并測定蛋白濃度；每孔30 μg總蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，半干轉至NC膜，5 %脫脂奶粉室溫封閉1h后，分別一抗(14-3-3ν，1∶1000；β-actin，1∶2000)4 ℃下孵育過夜。TBST漂洗后，再加HRP標記的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗后，采用化學發光法顯影。

1.3.7裸鼠體內轉移實驗5～7 周齡雄性裸鼠，在恒溫恒濕環境下飼養。取穩定表達miR-217或NC的Luciferase標記的SGC7901細胞細胞，消化計數并調整濃度至 1×107個/ml，每只裸鼠尾靜脈注射 0.2 ml，每組接種7只，自接種日起每周觀察 1 次。7 周后，利用小動物成像系統觀察Luciferase信號強度。

1.4統計學分析每次實驗至少重復三次，用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理，均數的比較采用t檢驗，P<0.05有統計學意義。

2結果

2.1miR-217在胃癌組織和胃癌細胞中的表達情況我們首先通過qRT-PCR驗證miR-217在20對胃癌與對應癌旁組織中的表達。結果表明，miR-217在胃癌組織中表達顯著高于對應癌旁組織(P<0.05)(圖1 A)。同時，我們發現miR-217在多個胃癌細胞系的表達比永生化正常上皮細胞GES明顯下降(P<0.05)(圖1 B)。這些結果提示miR-217可能在胃癌發生發展中具有重要作用。

圖1miR-217在胃癌和癌旁組織，胃癌細胞系和正常胃黏膜永生化細胞系中的表達情況

Figure 1miR-217 expression in gastric cancer, adjacent normal tissues, gastric cancer cell line and normal immortalized gastric epithelial cells

注：A.qRT-PCR檢測miR-217在20對胃癌及癌旁組織中的表達；B.qRT-PCR檢測miR-217在胃癌細胞系和正常胃癌上皮細胞中的表達

2.2miR-217過表達能夠抑制胃癌細胞遷移侵襲能力為明確miR-217在胃癌轉移中的作用，分別用miR-217 mimics或inhibitors上調或抑制其表達(圖2 A)，觀察對胃癌細胞轉移能力的影響。Transwell結果發現過表達miR-217 mimics細胞中，遷移細胞數為(86±16)個/200倍視野，而NC組遷移細胞數(159±3)個/200倍視野，差異有統計學意義。而在SGC7901細胞中轉入miR-217 inhibitors下調其表達，其遷移細胞數為(215±30)個/200倍視野，而NC組遷移細胞數(145±23)個/200倍視野，細胞遷移和侵襲能力明顯增強(P<0.05)(圖2B、C)。

我們進一步構建了miR-217的慢病毒表達載體及其對照載體，并分別感染穩定表達Luciferase的SGC7901細胞，分別命名為LV-miR-217和LV-NC。qRT-PCR證實miR-217在穩定表達細胞系中高表達(P<0.05)(圖2D)。取14只裸鼠，隨機分為2組后，通過尾靜脈注射分別建立胃癌體內轉移裸鼠模型。7周后，采用體內成像系統，觀察胃癌轉移情況。發現尾靜脈注射后LV-miR-217細胞的裸鼠中，Luciferase信號比LV-NC組明顯降低。在LV-NC組中，7只裸鼠僅有1只發現轉移灶；而在LV-miR-217組中，有5只裸鼠發現轉移灶(P<0.05)(圖2 E)。這些結果表明，miR-217能夠明顯降低SGC7901細胞的轉移能力。

2.314-3-3ν是miR-217的靶基因我們通過Targetscan等生物信息學軟件預測，發現14-3-3ν是miR-217的靶基因(圖3A)。我們構建了野生型(wt)和突變型(mut)14-3-3ν熒光素酶報告基因載體。將14-3-3ν-wt和14-3-3ν-mut質粒分別與miR-217質粒、空載體(NC)共轉染，或單獨轉染(Vehicle) SGC7901細胞。48 h后檢測細胞的熒光素酶活性。結果顯示：14-3-3ν-wt與miR-217質粒共轉染組熒光素酶活性為0.55±0.6，較NC組熒光素酶活性(1.0±0.10)和空白對照組熒光素酶活性(0.95±0.11)，差異有統計學意義(P<0.05)，陰性對照與空白對照相比，差異無統計學意義(P>0.05)。而14-3-3ν-mut與miR-217共轉染組熒光素酶活性為0.95±0.05，與陰性對照組熒光素酶活性(0.94±0.09)和空白對照熒光素酶活性(0.98±0.09)比較，差異無統計學意義(P>0.05) (圖3B)。這些結果提示miR-217過表達顯著抑制14-3-3ν-wt熒光素酶的活性；而對在14-3-3ν-mut的熒光素酶活性沒有明顯抑制作用。

Western blot結果顯示，SGC7901細胞過表達miR-217后，14-3-3ν的 mRNA和蛋白表達均明顯低于NC(圖3C)。用 miR-217 的抑制劑下調 GC9811 細胞中 miR-217 的表達時，14-3-3ν的mRNA和蛋白表達均升高，提示 miR-217 負性調控 14-3-3ν的表達。

我們將14-3-3ν-wt和14-3-3ν-mut的表達載體分別轉入SGC7901細胞中，western blot檢測發現其14-3-3ν表達均明顯上調。轉染miR-217后，發現14-3-3ν-wt明顯能被miR-217抑制，然而3′-UTR突變的14-3-3ν-mut的表達并沒有被miR-217下調(圖3D)，說明miR-217通過作用于14-3-3ν的3′-UTR來抑制其表達。

3討論

本研究在胃癌中開展miR-217的功能探討，我們通過檢測miR-217在胃癌組織和胃癌細胞系中的表達闡明了miR-217通過其下游靶基因14-3-3ν抑制胃癌轉移的作用及機制，為將miR-217作為胃癌的分子標志物以及轉移靶向分子提供了重要依據。

圖2體內外實驗表明miR-217能夠抑制胃癌轉移

Figure.2 miR-217 inhibited metastasis of gastric cancer both in vitro and in vivo

注：A.轉染miR-217 mimics或inhibitors之后，qRT-PCR檢測miR-217表達；B、C.Transwell檢測轉染miR-217 mimics或inhibitors對SGC7901細胞轉移能力的影響；D.穩定轉染miR-217或對照慢病毒后，qRT-PCR檢測miR-217的表達情況；E.體內轉移模型檢測穩定轉染miR-217對SGC7901細胞轉移能力的影響

MicroRNA 通過作用于靶基因mRNA的3′非編碼區，抑制其翻譯或促進其降解，在轉錄后水平負性調控靶基因的表達[2, 4, 7]。近來研究也證實microRNA參與了腫瘤發生和演進的各個階段，如轉移、增殖和耐藥[8-10]。胃癌轉移涉及侵襲基膜、體內播散、遠端定殖等多個過程[2, 3]。miRNA作為基因的重要調控分子，參與轉移的各個步驟[10]。已有研究提示miR-217可能在腫瘤轉移中發揮重要作用，但先前的研究表明miR-217在不同的惡性腫瘤中所發揮的功能不一致[11-13]。研究發現miR-217能夠靶向KRAS抑制胰腺癌生長[5]，miR-217還能夠靶向E2F3抑制肝癌轉移[6]，也有研究發現miR-217具有促癌作用[14]。本研究通過體內外實驗都證明miR-217的過表達能引起胃癌細胞轉移能力的下降，進一步通過熒光素酶報告基因實驗證實miR-217通過靶向14-3-3ν抑制胃癌轉移的機制。miR-217的作用可能并非僅集中在抑制侵襲轉移方面，可能在多種胃癌惡性生物學行為中發揮作用，還有待更多的實驗證明。14-3-3家族分子在腫瘤中具有重要作用[15-17]，其中，14-3-3ν是14-3-3家族中的重要成員，在肺癌、乳腺癌中高表達，并與患者預后相關[16, 17]。在肺癌中，14-3-3ν受到p53的抑制。當p53缺失時，14-3-3ν表達增高，可能參與肺癌的發生發展[16, 18]。本研究率先發現miR-217能夠直接靶向14-3-3ν，抑制胃癌轉移。這些結果提示，14-3-3ν發揮了癌基因的作用，在胃癌等多種腫瘤的惡性生物學表型的發生發展中發揮了重要作用。

圖314-3-3ν是miR-217的靶基因

Figure 314-3-3ν is a target gene of miR-217

注：A。生物信息學分析miR-217與14-3-3ν的結合位點；B.SGC7901細胞分別共轉染Luc-14-3-3ν-wt或Luc-14-3-3ν-mut和NC或miR-217后，檢測相對Luciferase熒光值。分別轉染miR-217 mimics或inhibitors之后，qRT-PCR檢測miR-217的表達情況；C.SGC7901細胞轉染miR-217 mimics或inhibitors后，14-3-3ν mRNA和蛋白的表達情況；D.SGC7901細胞轉染14-3-3ν-wt或14-3-3ν-mut，或同時轉染miR-217 mimics后，檢測14-3-3ν的蛋白表達

4結論

本研究發現miR-217/ 14-3-3ν這一抑制胃癌轉移的重要通路，為胃癌靶向治療提供了新的潛在靶點。通過恢復miR-217的表達或抑制14-3-3ν的表達，有可能提高胃癌轉移的治療效果。

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miR-217 inhibits gastric cancer metastasis by targeting 14-3-3ν

LEI Wei,DENG Mingming

(DepartmentofDigestiveDiseases,SichuanMedicalUniversity,Luzhou646000,Sichuan,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role and mechanisms of miRNA-217 (miR-217) in inhibition of gastric cancer metastasis. MethodsqRT-PCR was used to evaluate miR-217 expression between gastric cancer tissues and paired adjacent tissues, gastric cancer cell lines and normal gastric epithelial cells. After transfection of miR-217 mimics or Inhibitors, transwell invasion assay was applied to the effect of miR-217 in gastric cancer cell metastasis; metastasis model in nude mice was used to observe the effect of miR-217 overexpression in metastasis of gastric cancer in vivo; Bioinformatics analysis revealed 14-3-3ν as a candidate target genes of miR-217. Luciferase activity of the luciferase reporter assay was used to detect the effect of miR-217 on wild-type and mutant 14-3-3ν in SGC7901 cells. Western blot was used to evaluate whether miR-217 affect protein expression of 14-3-3ν and its mutant. ResultsThe expression of miR-217 in gastric cancer tissues was significantly decreased, compared with adjacent normal tissues (P<0.01). miR-217 expression level in the gastric cancer cells was significantly reduced, compared with normal gastric epithelial cell GES (P<0.01). MiR-217 mimics significantly inhibited invasion of SGC7901 cells, compared with the negative control (P<0.01). While miR-217 inhibitors significantly promoted invasion of SGC7901 cells (P<0.01); stable expression of miR-217 in SGC7901 cells demonstrated a reduced invasion capacity in vivo. Luciferase reporter assay showed that miR-217 inhibited luciferase activity of 14-3-3ν by targeting its 3′-UTR region; Western blot assay showed SGC7901 cells transfected with miR-217 significantly decreased 14-3-3ν expression, compared with the negative control. Western blotting showed that overexpression of miR-217 significantly inhibited the expression of14-3-3ν-wt, but not 14-3-3ν-mut. Conclusion MiR-217 inhibits gastric cancer metastasis by targeting 14-3-3ν. Restore of miR-217 expression or 14-3-3ν inhibition may be effective for the treatment of gastric cancer metastasis.

【Key words】Gastric cancer; Metastasis; miRNA; miR-217; 14-3-3ν

(收稿日期：2015-09-27； 編輯： 何興華)

【中圖分類號】R 735.2

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.04.003

通訊作者：雷微，E-mail：hileiwei@163.com

基金項目：國家自然科學基金(30973422)