七氟醚對大鼠急性肺損傷NF-кB活性的影響及肺保護作用△

傅艷妮　胡楚文　劉　玲　紀風濤（中山大學孫逸仙紀念醫院　廣州510120）

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七氟醚對大鼠急性肺損傷NF-кB活性的影響及肺保護作用△

傅艷妮胡楚文劉玲紀風濤*（中山大學孫逸仙紀念醫院廣州510120）

摘要：目的：應用大鼠酸吸入急性肺損傷模型，在酸吸入損傷后早期吸入七氟醚，觀察對大鼠急性肺損傷NF-кB活性的影響及肺保護作用。方法：隨機將SD大鼠分為5組（n=16），生理鹽水組：氣管內注入生理鹽水1mL/kg；鹽酸吸入組：氣管內注入pH=1.25鹽酸溶液1mL/kg；七氟醚處理組：氣管內注入鹽酸溶液，并分為3個亞組（七氟醚0．5h組，七氟醚1h組，七氟醚2h組），分別在給予鹽酸溶液1h后，吸入2．4%七氟醚0．5h、1h、2h。于注入生理鹽水或稀鹽酸5h后處死各組大鼠，檢測肺組織NF-кB活性及肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的濃度。結果：與生理鹽水組比較，鹽酸吸入組肺組織NF-кB/p65陽性細胞增多（P＜0.01），七氟醚處理1h與2h后陽性細胞較鹽酸吸入組減少（P＜0．05）；鹽酸吸入組肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的濃度較對照組增高（P＜0.01），七氟醚處理1h與2h后，與鹽酸吸入組比較，TNF-a、IL-6的濃度降低（P＜0．05），IL-10的濃度無明顯改變。結論：七氟醚對酸吸入急性肺損傷可起部分保護作用，其機制與抑制NF-кB在大鼠肺組織中激活有關。

關鍵詞：七氟醚急性肺損傷NF-кB炎癥反應

麻醉期間，酸性胃內容物反流誤吸入肺是導致急性肺損傷的臨床常見原因之一。七氟醚是臨床最常用的含氟類揮發性吸入麻醉劑，揮發性麻醉藥物對機體影響及作用機制的研究多集中于腦、心、肝臟等臟器，對肺的影響研究較少。有研究顯示含氟類揮發性吸入麻醉劑對正常肺的影響并非有利[1]，但大量離體或整體動物實驗證實，吸入七氟醚對心肌及腦缺血再灌注損傷有保護作用，可有效減少心肌和腦的梗死體積，減輕細胞損傷，抑制或延緩細胞凋亡、壞死[2]。核因子-кB（NF-κB）存在于肺內多種細胞中，NF-кB活化與肺部炎癥反應密切相關。本研究擬應用大鼠酸吸入急性肺損傷模型，在酸吸入損傷后早期吸入七氟醚，觀察對大鼠急性肺損傷NF-кB活性的影響及肺保護作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組：健康清潔級雄性SD大鼠80只，體質量220～250g（中山大學動物中心提供）。隨機分為5組，每組16只。生理鹽水組：氣管內注入生理鹽水1mL/kg；鹽酸吸入組：氣管內注入pH=1.25鹽酸溶液1mL/kg；七氟醚處理組：氣管內注入鹽酸溶液，分為3個亞組（七氟醚0．5h組，七氟醚1h組，七氟醚2h組），分別在給予鹽酸溶液1h后，吸入2．4%七氟醚0．5h、1h、2h。

1.2動物模型及七氟醚處理：各組大鼠腹腔注射戊巴比妥40mg/kg麻醉，頸部正中切口，顯露并穿刺氣管，滴注生理鹽水1mL/kg或pH=1.25鹽酸溶液1mL/kg。1h后將七氟醚組大鼠放入自制密封箱，兩端各有一進氣孔和出氣孔，底部鋪薄層鈉石灰，進氣口與裝有七氟醚氣體揮發罐的麻醉機（美國歐米達公司）連接，設定載入氧氣濃度為40%，出氣口接麻醉氣體監測儀（美國歐米達公司），調整揮發罐和新鮮氣流至出氣口七氟醚（美國雅培制藥有限公司）濃度為2．4%，大鼠自主呼吸，分別吸入七氟醚0.5h、1h、2h。

1.3樣本制備：注入生理鹽水或稀鹽酸5h后，經頸動脈放血處死大鼠。快速開胸取出完整肺臟，結扎右支氣管，取大鼠右肺下葉，10%中性甲醛固定后，石蠟包埋，4μm切片免疫組化染色。4℃生理鹽水灌洗左肺，收集肺泡灌洗液，離心取上清液-80℃保存，ELISA法檢測肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子-a（TNF-a）、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-10（IL-10）的濃度。

1.4結果判定：采用即用型超敏S-P免疫組化試劑盒（福州邁新公司）測定NF-кB的活性，抗p65單克隆抗體與NF-кB亞單位p65區域結合。正常情況下此結合區域被NF-кB抑制蛋白IкB覆蓋，抗p65單克隆抗體不能與之結合，只有當IкB釋放后，才能結合，故該抗體能夠原位檢測到NF-кB的活化。ELISA法檢測肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的濃度。

1.5統計學方法：應用SPSS13．0統計學軟件進行分析，所有數據以均數±標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，多組兩兩比較采用q檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1實驗動物一般情況：5組大鼠體重、雌雄分布無顯著差異（P＞0．05）。大鼠在實驗過程中無一死亡。

2.2肺組織NF-кB/p65陽性細胞率：與生理鹽水組比較，鹽酸吸入組及七氟醚處理組，肺組織NF-кB/p65陽性細胞明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01）；與鹽酸吸入組比較，七氟醚處理1h與2h陽性細胞明顯減少（P＜0．05），七氟醚處理0.5h無明顯差異（P＞0．05），見表1。

表1　各組大鼠肺組織NF-кB陽性細胞率比較（n）

2.3肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的含量：與生理鹽水組比較，鹽酸吸入組及七氟醚處理組，肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6 和IL-10的濃度明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與鹽酸吸入組比較，七氟醚處理1h與2h TNF-a、IL-6的濃度明顯降低（P＜0．05），七氟醚處理0.5h無明顯差異（P＞0．05）；IL-10的濃度無明顯改變，見表2。

表2　肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的含量（pg/ml，n=16，±s）

表2　肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的含量（pg/ml，n=16，±s）

△：與對照組比較：P＜0.01；▲：與鹽酸吸入組比較P＜0.05。

生理鹽水組　鹽酸吸入組　七氟醚處理0.5h七氟醚處理1h七氟醚處理2h TNF-a 48.35±12.18 273.41±31.22△261.12±34.12△227.31±29.33△▲197.46±22.13△▲IL-6　 55.67±17.23 312.58±28.96△306.71±32.98△274.39±27.43△▲233.54±25.72△▲IL-10　 37.92±6.53　 219.64±19.25△207.24±26.41△199.75±23.37△　201.68±30.63△

3　討論

七氟醚因對呼吸道刺激性小，不易引起氣道痙攣，起效迅速，蘇醒快，是臨床最常用的含氟類揮發性吸入麻醉劑。肺是揮發性吸入麻醉藥物首先直接作用部位，有研究顯示，正常肺臟吸入1.5MAC七氟醚2h后，某些促炎性細胞因子基因表達增加，但肺臟濕/干重比沒有明顯改變，病理學變化輕微，沒有出血、水腫及炎性細胞浸潤[1]。但大量離體或整體動物實驗提示，七氟醚對心肌及腦缺血再灌注損傷等有保護作用，可有效減少心肌和腦的梗死體積，減輕細胞損傷，抑制或延緩細胞凋亡壞死。

本實驗于大鼠氣道內注入鹽酸溶液，模擬急性肺損傷模型，并于損傷早期吸入1MAC七氟醚，并維持不同時長。本研究結果顯示急性肺損傷肺組織NF-кB/p65陽性細胞率較生理鹽水組明顯增高，七氟醚處理1h與2h后陽性細胞顯著減少。NF-кB是一種重要的轉錄因子，通過調控參與炎癥反應的細胞因子、炎癥介質、粘附分子及蛋白酶類的基因轉錄在炎癥反應中起重要作用。NF-κB存在于肺內中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞等免疫反應細胞中。許多炎癥介質如IL-1，IL-6，TNF-a，GM-CSF等都受NF-кB活化調控，與肺部炎癥反應密切相關。激活的NF-кB可增強TNF-a、IL-6等眾多細胞因子的轉錄，使炎癥細胞合成炎癥因子的時間縮短和數量增加[3]。因此，NF-KB是核內炎性遞質基因轉錄的開關，阻斷NF-кB活化，可減少炎癥介質產生，減輕炎癥介質對肺的損傷。

TNF-a是炎癥反應和急性肺損傷過程中最早釋放的細胞因子，主要由單核/巨噬細胞產生，為炎癥反應中重要啟動因子，并受NF-кB活化調控。IL-6由單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等在攝取抗原抗體復合物后或在抗原呈遞過程中產生。TNF-a和IL-6釋放，激活炎性級聯反應細胞因子、脂性遞質及活性氧簇；還可上調細胞黏附分子，最終促使炎性細胞浸潤到組織內[4]。

本實驗中，急性肺損傷大鼠經七氟醚處理，肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6濃度升高被抑制，提示七氟醚通過降低TNF-a 和IL-6濃度減輕肺部炎癥反應。七氟醚處理組灌洗液中TNF-a 和IL-6濃度與對照組比較仍升高，表明七氟醚處理不能完全抑制炎癥反應，但可起部分保護作用。IL-10是一種多功能炎癥反應負性調節因子，能夠參與免疫細胞、炎癥細胞等多種細胞生物調節，主要作用是抑制促炎細胞因子釋放[5]。本實驗中我們觀察到七氟醚處理后肺泡灌洗液中IL-10濃度無明顯變化，可能與七氟醚發揮免疫調節作用使抗炎細胞因子與促炎細胞因子保持平衡有關。

綜上所述，七氟醚雖不能完全抑制鹽酸溶液所致急性肺損傷炎癥反應，但可起部分保護作用，其機制可能與七氟醚抑制NF-кB在大鼠肺組織中激活，從而減少炎癥介質釋放，減輕炎癥反應對肺損傷有關。

參考文獻

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Effects of sevoflurane on hydrochloric acid aspiration induced acute lung injury in rats

Fu Yanni Hu Chuwen Liu Ling Ji Fengtao*（SunYat—Sen Memorial Hosital，SunYat—Sen University，Guangzhou 510120）

Abstract：Objective：To observe the effect of sevoflurane on hydrochloric acid aspiration induced acute lung injury in rats. Methods：80 rats were randomly divided into 5 groups（n=15）：NS group，HCL group，NS（1mL/kg）or HCL（1mL/kg）was instilled in rats airway．Sevoflurane groups（Sevo 0.5 h group，Sevo 1 h group，Sevo 2 h group）：One hour after HCL instillation，rats received 2.4%sevoflurane inhalation respectively for thirty minutes，one hour or two hours．Five hours after NS or HCL instillation，all groups were exsanguinated．The nurmber of NF-кB positive cells in lung tissue and the concentration of TNF-a，IL-6，IL-10 in BALF were measured. Results：book=113,ebook=120Compared with the NS group，after HCL instillation，the nurmber of NF-кB positive cells and the concentration of TNF-a，IL-6，IL-10 in BALF significantly increased（P＜0．01）. Compared with the HCL group，in sevoflurane groups（Sevo 1 h group and Sevo 2 h group），the nurmber of NF-кB positive cells and the concentration of TNF-a，IL-6 in BALF decreased（P＜0．05）. Conclusion：Sevoflurane could attenuate lung inflammation in rats with hydrochloric acid induced acute lung injury，inhibit activity of NF-кB and possess potential protective effects．

Key words：Sevoflurane Acute lung injury NF-кB Inflammation

*通訊作者

基金項目：△廣東省醫學科學技術研究基金（A2013206）

中圖分類號：R614

文獻標識碼：B

文章編號：1672-8351（2016）04-0112-03