C/EBPs和內質網應激相關分子在高三酰甘油血癥性急性胰腺炎大鼠胰腺中的表達

鄭俊媛　吳江紅　陳靜　劉杰　胡國勇　王興鵬　曾悅

200080　上海，上海交通大學附屬第一人民醫院消化科

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·論著·

C/EBPs和內質網應激相關分子在高三酰甘油血癥性急性胰腺炎大鼠胰腺中的表達

鄭俊媛吳江紅陳靜劉杰胡國勇王興鵬曾悅

200080上海，上海交通大學附屬第一人民醫院消化科

【摘要】目的探討C/EBPα、C/EBPβ和內質網應激相關分子(IRE1α和sXBP1)在高三酰甘油血癥(HTG)相關性急性胰腺炎(AP)大鼠胰腺中的表達變化。方法96只SD大鼠按數字表法隨機分為對照組、HTG組(高脂飲食2周)、AP組、HTG+AP組，每組24只。采用腹腔注射雨蛙肽方法制備AP模型，造模后3、6、9、24 h分批處死大鼠。觀察胰腺病理變化并予評分，檢測血清TG、總膽固醇(TC)及血漿IL-1β、IL-6、TNF-α水平，實時PCR法檢測胰腺組織IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA表達，蛋白質印跡法檢測胰腺組織IRE1α、sXBP1、NF-κB、C/EBPα和C/EBPβ蛋白表達，免疫組化法檢測胰腺組織C/EBPα和C/EBPβ蛋白表達。結果高脂飲食2周后，HTG組、HTG+AP組大鼠血清TG和TC均較對照組明顯升高，差異有統計學意義(P值均<0.05)。HTG+AP組胰腺病理變化較AP組更嚴重，以9 h點表現最為顯著(P<0.05)。與AP組比較，HTG+AP組血漿IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯升高，9 h點差異有統計學意義(P值分別為0.011、0.034、0.027)。AP組和HTG+AP組胰腺組織IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA表達均于3 h點開始升高，分別于24、9、6、6 h點達峰值。與AP組比較，HTG+AP組IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA表達明顯更高，其中IRE1α、sXBP1 mRNA 3、6、9、24 h點，C/EBPα mRNA 6、9、24 h點，C/EBPβ mRNA 6、9 h點差異均有統計學意義(P值均<0.05)。AP組和HTG+AP組胰腺組織IRE1α、sXBP1、NF-κB蛋白表達均于3 h點開始上調，9 h點達最高水平，HTG+AP組較AP組上調更顯著；HTG+AP組6 、9 h點C/EBPα、C/EBPβ蛋白高表達，AP組則無表達。結論C/EBPα、C/EBPβ、IRE1α、sXBP1基因參與HTG相關性AP的發病，內質網應激通路IRE1α/sXBP1和C/EBPα、C/EBPβ可能共同介導HTG性AP的胰腺病理損傷和炎癥過程。

【關鍵詞】胰腺炎；C/EBPα；C/EBPβ；內質網應激；高酯血癥；大鼠

高三酰甘油血癥(hypertriglyceridemia，HTG)是急性胰腺炎(AP)發病的一個僅次于膽源性和酒精性、明確而獨立的危險因素。HTG性AP占所有AP病例的10%，在妊娠期AP中的比例則高達50%[1]。HTG性AP的病情重癥化和炎性反應擴大化[2]早有定論，但具體機制尚不明確。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是近年來在細胞生物學層面上提出的一個較新穎的AP發病機制，而高脂飲食本身也能夠誘發肝臟、脂肪、骨骼肌等組織發生ERS[3]，尤其是與脂代謝和炎癥都有關聯的IRE1α-sXBP1通路[4]。C/EBPs(CCAAT enhancer binding proteins)是一個包括C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε、C/EBPξ 6個成員的轉錄因子家族，其C端都具有高度保守的、堿性亮氨酸拉鏈結構的DNA結合域和二聚化功能域，N端則為轉錄激活域。該家族具有調控細胞增殖和分化、能量代謝、炎癥、學習和記憶等多種功能。本研究檢測ERS相關分子(IRE1α、sXBP1)和C/EBPα、C/EBPβ在HTG性AP胰腺組織的表達，分析它們間的關系。

材料和方法

一、動物模型制備和實驗分組

96只雄性SD大鼠，SPF級，體重150～ 160 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。按數字表法隨機分為對照組、AP組、HTG組、HTG+AP組，每組24只大鼠。對照組給予正常飲食喂養；AP組給予正常飲食喂養2周后采用腹腔注射雨蛙肽50 μg/kg體重2次、間隔1 h的方法制備AP模型；HTG組給予高脂飼料(正常飼料77%+豬油20%+膽固醇3%)喂養2周； HTG+AP組給予高脂飼料喂養2周后同上述方法制備AP模型。對照組和HTG組腹腔注射等容積生理鹽水。AP誘發后3、6、9、24 h處死大鼠，腹主動脈采血，分離血漿，置-20℃保存；取胰腺組織，部分立即置液氮保存，部分用10%甲醛固定備用。

二、血三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、IL-1β、IL-6、TNF-α檢測

正常飲食或高脂飲食喂養2周后大鼠尾靜脈采血，分離血清送上海市第一人民醫院生物化學實驗室檢測血TG、TC水平，分離的血漿應用ELISA試劑盒(eBioscience)檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平，按說明書操作。

三、胰腺組織病理檢查

取固定的胰腺組織，常規脫水、石蠟包埋、切片及HE染色，光鏡下讀片，并參照Schmidt等[5]的胰腺組織病理評分標準進行評分。

四、胰腺組織IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA檢測

應用Trizol(Invitrogen)抽提胰腺組織總RNA，應用RT試劑盒和SYBGreen熒光定量PCR試劑盒(Takara公司)進行逆轉錄及實時PCR反應，按說明書操作。 IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ、β-actin引物由上海生工生物技術有限公司設計并合成，引物序列和退火溫度見表1。 通過PCR儀自帶軟件獲取Ct值，根據公式2-ΔΔCt計算mRNA表達量。

表1　各基因引物序列及退火溫度

五、胰腺組織IRE1α、sXBP1、NF-κB、C/EBPα、C/EBPβ蛋白檢測

應用RIPA裂解液提取胰腺組織總蛋白，用核蛋白抽提試劑盒(碧云天生物技術有限公司)提取核蛋白，應用BCA試劑盒(碧云天生物技術有限公司)測定蛋白濃度。采用蛋白質印跡法檢測IRE1α、sXBP1、NF-κB、C/EBPα、C/EBPβ蛋白表達量，以Tubulin為內參，最后ECL(Millipore公司)化學發光。 兔抗大鼠 IRE1α、sXBP1、NF-κB、C/EBPα、C/EBPβ抗體購自Santa Cruz公司，工作濃度分別為1∶250、1∶400、1∶400、1∶250、1∶250；羊抗兔IgG-HRP購自Jackson公司，工作濃度1∶5 000。應用天能Tanon 5200全自動化學發光成像分析系統掃描，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白表達量。

取固定的胰腺組織，石蠟包埋、切片，采用免疫組化方法檢測C/EBPα、C/EBPβ蛋白表達，最后DAB顯色，蘇木精復染，封片，光鏡下讀片。以胞質和(或)胞核出現棕黃色顆粒為陽性表達。蛋白表達強度結果判定標準：無染色為陰性，陽性細胞占全片1/3以下為弱陽性，占全片1/3 ～2/3為陽性，占全片2/3以上為強陽性。

六、統計學分析

結果

一、血清TG、TC水平及胰腺組織病理變化

對照組、AP組、HTG組、HTG+AP組血清TG分別為(0.67±0.25)、(0.64±0.18)、(4.41±0.94)、(4.45±0.84)mmol/L；TC分別為(2.17±0.20)、(2.19±0.30)、(2.87±0.45)、(2.96±0.55)mmol/L。兩高脂飼料喂養組大鼠的TG、TC水平均顯著高于兩正常飼料喂養組，差異均有統計學意義(TG：t值分別為9.378、10.784，P值均<0.001；TC：t值分別為3.184、2.765，P值均<0.05)。

對照組和HTG組的胰腺組織病理無明顯變化，病理評分基本為0分。AP組和HTG+AP組胰腺組織均出現不同程度的水腫、出血、壞死和炎性浸潤，尤以9 h點病變最為嚴重。AP組胰腺組織病理評分顯著高于對照組，HTG+AP組則顯著高于HTG組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。HTG+AP組的胰腺病理改變較AP組更嚴重，尤以水腫和腺泡壞死為甚(t=3.464，P=0.026；t=5.292，P=0.006)。HTG+AP組胰腺病理總評分、水腫和壞死評分較AP組同時點顯著增加，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，而出血和炎性浸潤評分差異僅在9 h點有統計學意義(P<0.05；圖1，表2)。

圖1　對照組(1A )、 AP 9 h組(1B)、HTG組(1C)、HTG+AP 9 h組(1D)大鼠胰腺組織病理改變(HE　×400)

二、血漿IL-1β、IL-6、TNF-α水平的變化

HTG組大鼠血漿IL-1β、IL-6、TNF-α水平與對照組差異無統計學意義。AP組、HTG+AP組大鼠血漿IL-1β、IL-6、TNF-α水平均較對照組、HTG組顯著升高，HTG+AP組又較AP組顯著升高。兩組9 h時的IL-1β分別為(115.31±3.09)、(62.58±1.32)ng/L；IL-6為(43.20±3.81)、(22.41±2.40)ng/L；TNF-α為(38.75±1.02)、(22.11±1.10)ng/L，差異均有統計學意義(t值分別為4.495、2.709、3.328，P值分別為0.011、0.034、0.027；圖2)。

三、胰腺組織IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA表達變化

與對照組比較，HTG組大鼠胰腺組織IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA表達呈現不同程度上調，但僅6、9、24 h點C/EBPα mRNA的表達差異有統計學意義(P值均<0.05)。AP組IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA表達均較對照組升高，其中IRE1α mRNA在9、24 h點，sXBP1 mRNA在6、9、24 h點，C/EBPα mRNA在3、6、9、24 h點，C/EBPβ mRNA在3、6 h的差異有統計學意義(P值均<0.05)。 HTG+AP組IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ mRNA也均較HTG組表達升高，其中IRE1α、sXBP1、C/EBPα mRNA在3、6、9、24 h點，C/EBPβ mRNA在3、6 h點的差異有統計學意義(P值均<0.05，表3)。

四、胰腺組織IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ、NF-κB蛋白表達的變化

HTG組和對照組大鼠胰腺組織IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ、NF-κB蛋白均低表達或未檢測到表達。AP組IRE1α、sXBP1、NF-κB蛋白表達均較對照組增加； HTG+AP組IRE1α、sXBP1、NF-κB蛋白表達均較HTG組、AP組增加。HTG+AP組C/EBPα和C/EBPβ蛋白高表達，其中C/EBPα蛋白6、9、24 h點，C/EBPβ蛋白3、6 h點表達均較AP組顯著增加，差異有統計學意義(P值均<0.05，圖3)。

表2　AP組和HTG+AP組大鼠胰腺組織病理評分

注：與AP組同時點比較，aP<0.05

注：與AP組比較，aP<0.05

組別只數IRE1αmRNA3h6h9h24h對照組241.00±0.021.09±0.151.07±0.071.04±0.03HTG組241.26±0.131.20±0.011.24±0.101.24±0.14AP組241.04±0.011.29±0.022.67±0.08a4.93±0.19aHTG+AP組242.88±0.07bc3.55±0.04bc4.99±0.12bc5.86±0.04bc組別只數sXBP1mRNA3h6h9h24h對照組241.00±0.021.30±0.201.29±0.110.89±0.08HTG組241.46±0.171.67±0.091.59±0.141.49±0.22AP組242.25±0.357.89±0.89a16.08±1.48a14.12±1.06aHTG+AP組247.29±2.08bc20.55±1.21bc25.56±1.38bc21.66±0.23bc組別只數C/EBPαmRNA3h6h9h24h對照組241.00±0.011.01±0.130.84±0.081.06±0.05HTG組241.31±0.124.03±1.00a4.89±0.97a4.44±0.86aAP組2411.16±2.17a16.68±3.11a15.67±2.65a11.08±1.77aHTG+AP組247.58±2.58c29.94±3.40bc21.90±1.93bc16.68±0.33bc組別只數C/EBPβmRNA3h6h9h24h對照組241.00±0.101.82±0.051.66±0.021.00±0.01HTG組242.89±0.233.61±0.313.27±0.111.66±0.44AP組248.17±1.50a10.56±1.61a2.57±0.691.00±0.07HTG+AP組248.64±1.25c18.13±2.09bc3.63±0.22b3.12±0.58

注：與對照組比較，aP<0.05；與AP組比較，bP<0.05；與HTG組比較，cP<0.05

圖3　對照組(1)、HTG組(2)及AP組(3)、HTG+AP組(4)3、6、9、24 h點胰腺組織IRE1α、sXBP1、NF-κB、C/EBPα、C/EBPβ蛋白表達

免疫組化染色顯示，HTG+AP組6、9 h點C/EBPα和C/EBPβ呈強陽性表達，而AP組則無表達(圖4)，與蛋白質印跡法檢測的結果一致。

討論

目前已有不少研究[6]發現，在多種AP模型中均存在ERS，包括ERS標志分子的mRNA和蛋白表達上調以及內質網擴張、液化和腔內出現大量空泡等形態結構的改變。ERS信號通路主要包括IRE1α-sXBP1、PERK-eIF2α和ATF6，其中IRE1α-sXBP1是ERS最經典最保守的一條信號通路，且與炎癥、糖脂代謝紊亂和脂肪細胞分化等都有密切關系[4,7]。Zhang等[8]采用蛋白質組學技術發現，與正常血脂的大鼠AP比較，HTG相關性AP大鼠胰腺的ERS相關蛋白，如GRP78等的表達顯著升高。本課題組前期研究結果也顯示[9]，HTG性AP的GRP78、sXBP1mRNA和蛋白表達顯著上調，腺泡細胞內的內質網極度擴張、空泡化，推測ERS可能是HTG性AP重癥化的一個重要機制。

近年來，肥胖、糖尿病、HTG等多種脂肪代謝性疾病在全球范圍內的流行使人們越來越關注脂肪沉積調控的機制研究，其中就包括調控脂肪細胞分化、葡萄糖和胰島素代謝以及高密度脂蛋白(HDL)生成的C/EBPα和C/EBPβ[10]。研究表明， 生脂基因調控因子C/EBPα和C/EBPβ還可調控炎性通路[11-12]。C/EBPα可通過激活巨噬細胞加重炎性反應[13]，但也是對抗炎性疾病的一個保護因子[14]。C/EBPβ可以上調炎性因子的表達加重神經炎性疾病和急性肺損傷[15-16]。高脂飲食能誘導脂肪細胞和巨噬細胞C/EBPβ的高表達進而上調IL-6、TNF-α、MCP1等炎性因子表達，而敲除C/EBPβ基因則可減輕高脂飲食誘發的炎癥和胰島素抵抗[17]。Ji等[18]

圖4　對照組(4A)、AP 9 h組(4B)、HTG組(4C)、HTG+AP 9 h組(4D)大鼠胰腺組織C/EBPα(上)、C/EBPβ(下)的表達(免疫組化　×400)

應用基因芯片技術檢測AP大鼠胰腺組織，發現1 h后C/EBPβ基因表達上調，是正常大鼠的8倍，2 h高達正常的16倍，4 h則是正常的9倍；而注射牛黃膽酸1 h后胰腺組織C/EBPβ基因上調至正常的17倍，3 h高達正常的20倍。

文獻報道C/EBPβ與ERS、炎癥和代謝障礙都有密切的聯系[10]，ERS可誘導C/EBPβ高表達，C/EBPβ可誘導NF-κB和炎性因子表達上調[17]。但尚無有關ERS和C/EBPα關系的文獻報道，且有關C/EBPα和C/EBPβ關系的報道也只限于在脂肪細胞分化過程中C/EBPβ誘導C/EBPα的表達。

本研究結果顯示，HTG+AP組的胰腺病理損傷更嚴重，血漿中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平更高，胰腺組織NF-κB的蛋白表達增強，證明HTG加重了AP的全身炎癥反應和胰腺病理損傷。HTG+AP組胰腺IRE1α、sXBP1、C/EBPα、C/EBPβ、NF-κB表達上調，血中炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平升高，進一步驗證ERS參與了HTG加重AP的過程。至于HTG性AP中IRE1α-sXBP1是否誘導C/EBPα和C/EBPβ的高表達，進而激活NF-κB，加重炎癥反應還有待進一步研究證實。

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(本文編輯：呂芳萍)

Alteration of C/EBPs and endoplasmic reticulum stress related molecules expression in pancreatic tissues in rats with hypertriglyceridemia related acute pancreatitis

ZhengJunyuan,WuJianghong,ChenJing,LiuJie,HuGuoyong,WangXingpeng,ZengYue.DepartmentofGastroenterology,ShanghaiFirstPeople′sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200080,China

【Abstract】Objective To investigate the alteration of C/EBP α, C/EBP β and endoplasmic reticulum stress (ERS) related molecules (IRE1 α and sXBP1) expression in pancreatic tissues in rats with hypertriglyceridemia related acute pancreatitis. MethodsNinety six Sprague Dawley (SD) rats were divided into 4 groups: control group, hypertriglyceridemia (HTG) group (n=24, fed with high fat diet for 2 weeks), AP group (n=24), HTG+AP group (n=24), and AP was induced by peritoneal injection of cerulein. The rats were sacrificed at 3, 6, 9, 24 h after AP induction, respectively. The pathological changes of the pancreatic tissues were observed and scored by HE staining. Plasma levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α weremeasured by ELISA. The expression of IRE1α, sXBP1, C/EBPα, C/EBPβ mRNA were analyzed by real time PCR. The expressions of IRE1α, sXBP1, NF-kB, C/EBPα and C/EBPβ protein were determined by Western Blot. The expressions of C/EBPα and C/EBPβ proteins were also determined by immunohitochemistry. ResultsAfter two weeks of high fat diet, serum levels of triglyceride(TG) and total cholesterol (TC) in HTG group, HTG+AP group were much higher than those of the control group, and the difference was statistically significant (P<0.05). The pancreatic tissue injury was more severe in HTG +AP group, particularly at 9 h (P<0.05). And plasma IL-1β, IL-6 and TNF-α levels were also much higher in HTG+AP group when compared with that of AP group, the differences were all significant at 9 h (P=0.011; P=0.034; P=0.027). After AP induction, IRE1, sXBP1, C/EBP and C/EBPβ mRNA began to be up-regulated at 3 h, and IRE1 mRNA reached the highest level at 24 h, sXBP1 mRNA at 9 h, while C/EBP and C/EBPβ mRNA reached the highest level at 6 h. Compared with AP group, IRE1, sXBP1, C/EBP and C/EBPβ mRNA levels were much higher in HTG+AP group. In addition, as to IRE1 and sXBP1 mRNA, the difference was significant at 3, 6, 9, 24 h, and C/EBP mRNA at 6, 9, 24 h, C/EBPβ mRNA at 6 and 9 h (P<0.05). After AP induction, IRE1α, sXBP1 and NF-kB proteins in the pancreatic tissue began to be up-regulated at 3 h, and all reached the highest level at 9 h. IRE1α, sXBP1 and NF-kB proteins were up-regulated more obviously in HTG+AP group, and the up-regulation in HTG+AP group was higher than that in AP group, and the high expressions of C/EBPα and C/EBPβ proteins could only be detected at 6 and 9 h in the HTG+AP group, while there was no expression detected in AP group. ConclusionsC/EBPα, C/EBPβ, IRE1α and sXBP1 may be involved in the pathogenesis of HTG related AP, and IRE1α/sXBP1 pathway and C/EBPα, C/EBPβ may mediate the pathologic injury and inflammation process of HTG related AP.

【Key words】Pancreatitis;C/EBPα;C/EBPβ;Endoplasmic reticulum stress;Hyperlipidemias;Rats

(收稿日期：2015-06-29)

Corresponding author:Zeng Yue, Email: carrie@medmail.com.cn

基金項目：國家自然科學基金青年項目(81200322)；上海市自然科學基金面上項目(12ZR1424000)；上海市胰腺疾病重點實驗室開放課題資助項目(SPDF2013004)

通信作者：曾悅，Email：carrie@medmail.com.cn

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.02.007

Fund program：Natural Science Foundation for Young Scholars of China (81200322); Shanghai Natural Science Foundation(12ZR1424000)；Open Project of Shanghai Key Laboratory of Pancreatic Diseases (SPDF2013004)