藍(lán)莓花色苷對(duì)2型糖尿病小鼠氧化損傷的保護(hù)作用

李亞巍，昌盛，王黎明，金瑛（吉林醫(yī)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，吉林吉林132013）

?

藍(lán)莓花色苷對(duì)2型糖尿病小鼠氧化損傷的保護(hù)作用

李亞巍，昌盛，王黎明，金瑛*
（吉林醫(yī)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，吉林吉林132013）

摘要：探討藍(lán)莓花色苷對(duì)2型糖尿病小鼠體內(nèi)抗氧化活性影響及肝臟的保護(hù)作用。采用高脂飲食聯(lián)合小劑量四氧嘧啶誘導(dǎo)的方法建立小鼠2型糖尿病模型。50只小鼠分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥（吡格列酮）組、藍(lán)莓花色苷低劑量（100mg/kg·d）給藥組和藍(lán)莓花色苷高劑量（200mg/kg·d）給藥組。陽(yáng)性藥及藍(lán)莓花色苷給藥組，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥30 d。末次給藥12小時(shí)后，測(cè)定小鼠空腹血糖，血清中及肝臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，并觀察小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)改變。與對(duì)照相比，模型組小鼠空腹血糖維持較高水平（P<0.01），小鼠血清及肝臟組織中SOD、GSH-Px活性明顯下降（P<0.01），而MDA含量明顯升高（P<0.01），小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)變性、間質(zhì)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)病理變化。與模型組相比，陽(yáng)性藥和藍(lán)莓花色苷給藥組小鼠血糖明顯降低（P<0.01），SOD和GSH-Px活性升高（P<0.01），MDA含量下降（P<0.01），肝臟病理變化有所改善。藍(lán)莓花色苷能夠通過(guò)減輕實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病小鼠機(jī)體的氧化損傷，并對(duì)肝臟損傷具有一定的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓花色苷；2型糖尿病小鼠；氧化損傷

越橘（Bilberry），又稱(chēng)藍(lán)漿果、藍(lán)莓果，屬于杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium.SPP），多年生落葉或常綠灌木[1-2]。藍(lán)莓果實(shí)橢圓形或偏球形，藍(lán)紫色，味道酸甜[3-4]，是我國(guó)重要的一種天然綠色野生資源，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。越橘中含有豐富的花色苷，花色苷是一種廣泛存在于植物中的功能性水溶色素，是一種天然的抗氧化劑，具有抗氧化、清除自由基等多種生理活性[5]。因此，其作為具有重要生理活性的天然著色劑，廣泛應(yīng)用于食品、藥品行業(yè)。國(guó)內(nèi)外對(duì)藍(lán)莓花色苷生理功能的研究主要集中在清除自由基作用、抗癌等方面，而其對(duì)體內(nèi)生理活性影響的研究還很少[6]。

本研究將從越橘花色苷抗氧化及對(duì)肝臟損傷的保護(hù)作用方面，探討其改善糖代謝的相關(guān)機(jī)制，為藍(lán)莓花色苷功能食品的開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1　材料與儀器

1.1材料與試劑

長(zhǎng)白山野生藍(lán)莓為8月份采收，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫磪⒖嘉墨I(xiàn)[7]方法，提取藍(lán)莓花色苷；高糖高脂飼料（蛋黃2.5 %、蔗糖20 %、豬油10 %、基礎(chǔ)飼料67.5 %）；四氧嘧啶：SIGMA公司；鹽酸吡格列酮片：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；膽固醇（TC）測(cè)定試劑盒、甘油三酯（TG）測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒：江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器

550酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Rad公司；UV-4802型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海UNICO儀器有限公司；TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；OLYMPUS光學(xué)顯微鏡：日本奧林巴斯（中國(guó)）有限公司；MTN-658自動(dòng)生化分析儀：長(zhǎng)春市曼特諾醫(yī)療器械有限公司。

1.3試驗(yàn)動(dòng)物

選取健康成年KM種小鼠80只，雄性，體重18 g～ 20 g，購(gòu)于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（吉）2008-0005。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，室溫18℃～28℃，相對(duì)濕度62 %～80 %。

2　試驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物前期飼養(yǎng)及處理

參考文獻(xiàn)[10]，建立2型糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，試驗(yàn)期間，嚴(yán)格按照動(dòng)物飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范進(jìn)行飼養(yǎng)。隨機(jī)選取出20只小鼠喂普通飼料，自由飲水，其余小鼠喂高糖高脂飼料，自由飲水。喂養(yǎng)8周后，兩組各隨機(jī)抽取4只小鼠禁食不禁水12 h，摘眼球取血，3 000 r/min離心5 min，取血清，進(jìn)行血脂檢測(cè)，喂高糖高脂飼料的小鼠血清中TC、TG較對(duì)照組顯著升高（P< 0.01），表明高脂動(dòng)物模型建模成功。取高脂模型小鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射小劑量四氧嘧啶（180 mg/kg）。72 h后，對(duì)小鼠進(jìn)行尾尖取血，用血糖儀檢測(cè)小鼠空腹血糖（檢測(cè)前12 h禁食不禁水），以血糖值≥10 mmol/L為建立2型糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)，篩選造模成功動(dòng)物。

2.2動(dòng)物分組及處理

選取喂養(yǎng)普通飼料的小鼠10只作為正常對(duì)照組；2型糖尿病模型小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，分別為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組吡格列酮（100 mg/kg·d）、越橘花色苷高劑量組（200mg/kg·d）、越橘花色苷低劑量組（100 mg/kg·d）。灌胃給藥，0.1 mL/10 g體重，連續(xù)30 d，正常對(duì)照組給予等體積生理鹽水。除正常對(duì)照組外，其余各組繼續(xù)喂高糖高脂飼料。

2.3生化指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥后，動(dòng)物禁食12 h采血，小鼠眼球取血，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定空腹血糖（FBG）。取血后小鼠立即采用頸椎脫臼處死，迅速取出肝臟，以冰冷生理鹽水清理血跡，吸干水分，準(zhǔn)確稱(chēng)量，并加入9倍無(wú)菌的冰冷生理鹽水手動(dòng)制成10 %的心臟勻漿，離心（4 000 r/min，10 min），上清液置于-85℃冰箱待用。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行測(cè)定血清和肝臟組織中SOD活性、GXH-Px活性、MDA含量。SOD和GXHPx活性及MDA含量的測(cè)定方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用分光光度計(jì)測(cè)定。

2.4肝臟織病理學(xué)檢查

小鼠處死后冰浴下立即取小鼠肝臟臟，固定于10 %福爾馬林溶液，病理切片常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，觀察肝細(xì)胞變性及壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫，血管反應(yīng)，纖維增生病理學(xué)變化。

2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件處理，對(duì)照組與給藥各組比較進(jìn)行單因素方差分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　試驗(yàn)結(jié)果

3.1越橘花色苷對(duì)小鼠空腹血糖的影響

通過(guò)高脂飲食小劑量四氧嘧啶誘導(dǎo)的方法建立2型糖尿病模型，檢測(cè)藍(lán)莓花色苷對(duì)2型糖尿病小鼠的治療作用。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠空腹血糖維持在較高的水平（P<0.01）。而與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和越橘花色苷給藥組空腹血糖呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　越橘花色苷對(duì)小鼠血糖的影響Fig.1 Effect of Buleberry anthocyanidin on the blood sugar of mouse

3.2越橘花色苷對(duì)小鼠血清中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影響

越橘花色苷對(duì)小鼠血清中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影響見(jiàn)表1。

表1　越橘花色苷對(duì)小鼠血清中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影響Tabe 1 The effect of Buleberry anthocyanidin on the activity of SOD and GSH-Px and the conten of MDA in mouse serum

表1結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px酶活力明顯降低（P＜0.01），而MDA含量升高明顯（P＜0.01）。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及藍(lán)莓花色苷高劑量及低劑量防護(hù)組小鼠血清中SOD、GSHPx酶活力升高明顯（P＜0.01），而MDA含量降低明顯（P＜0.01）。

3.3越橘花色苷對(duì)小鼠肝臟中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影響

越橘花色苷對(duì)小鼠肝臟組織中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影響見(jiàn)表2。

表2結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟中SOD、GSH-Px酶活力明顯降低（P＜0.01），而MDA含量升高明顯（P＜0.01）。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及藍(lán)莓花色苷高劑量及低劑量防護(hù)組小鼠肝臟中SOD、GSHPx酶活力升高明顯（P＜0.01），而MDA含量降低明顯（P＜0.01）。由結(jié)果可以看出，越橘花色苷能夠顯著改善

表2　越橘花色苷對(duì)小鼠肝臟組織中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影響Tabe 2 The effect of Buleberry anthocyanidin on the activity of SOD and GSH-Px and the conten of MDA in mouse hepar

2型糖尿病小鼠肝臟內(nèi)氧化應(yīng)激水平，從而對(duì)糖代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。

3.4越橘花色苷對(duì)2型糖尿病模型小鼠肝臟病理改變的影響

病理切片檢測(cè)表明，正常組小鼠肝臟組織中見(jiàn)個(gè)別肝細(xì)胞變性，其余肝細(xì)胞無(wú)變性壞死，偶見(jiàn)間質(zhì)血管充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)間質(zhì)水腫。與正常組相比，模型組小鼠肝臟組織中肝細(xì)胞變性、間質(zhì)血管充血、間質(zhì)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)部分非常明顯；與模型組相比，陽(yáng)性給藥組、越橘花色苷高劑量組和低劑量組小鼠肝臟組織中肝細(xì)胞變性、間質(zhì)血管充血、間質(zhì)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)部分明顯較少，表明越橘花色苷對(duì)2型糖尿病小鼠肝臟組織損傷具有一定的改善作用，見(jiàn)圖2。

圖2　肝臟組織病理切片（400X）Fig.2 Pathological sections of liver tissues（400X）

4　討論

近年的研究表明，2型糖尿病是一種與氧化損傷密切相關(guān)的內(nèi)分泌常見(jiàn)疾病，無(wú)論是2型糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物還是患者體內(nèi)，確實(shí)存在氧化損傷相關(guān)指標(biāo)的改變，進(jìn)行抗氧化治療能抑制或延緩2型糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[8-10]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于藍(lán)莓的研究主要集中在抗氧化、抗癌等方面。但有關(guān)藍(lán)莓花色苷通過(guò)抗氧化改善糖代謝的研究報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食小劑量四氧嘧啶誘導(dǎo)的方法建立2型糖尿病模型，探討藍(lán)莓花色苷對(duì)對(duì)2型糖尿病的治療作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠空腹血糖維持在較高的水平，而陽(yáng)性對(duì)照組和越橘花色苷給藥組空腹血糖呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明藍(lán)莓花色苷對(duì)2型糖尿病小鼠具有一定的治療作用。正常機(jī)體內(nèi)自由基代謝維持動(dòng)態(tài)平衡，是由于存在有效的自由基清除系統(tǒng)。最重要的有SOD和GSH-Px，二者聯(lián)合起來(lái)清除體內(nèi)的氧自由基。在慢性高血糖狀態(tài)下SOD和GSH-Px等可發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)，使其清除自由基的能力明顯下降，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物MDA生成增多[11]。可以間接反映機(jī)體內(nèi)氧自由基的代謝狀況、組織細(xì)胞受自由基損傷的程度及脂質(zhì)過(guò)氧化程度[12]。研究結(jié)果顯示，越橘花色苷能夠顯著提升2型糖尿病小鼠血清中SOD和GSH-Px的活力，降低其血清中MDA的含量，說(shuō)明越橘花色苷能夠有效清楚體內(nèi)活性氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物，保護(hù)機(jī)體免受自由基的損傷。

近年研究發(fā)現(xiàn)，肝臟是物質(zhì)代謝的重要器官，也是常見(jiàn)的糖尿病慢性損傷的靶器官之一，肝臟中存在大量的胰島素受體，當(dāng)肝臟得不到滋養(yǎng)時(shí)，必然會(huì)使代謝所產(chǎn)生的有害物質(zhì)積聚，進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞線粒體，使其能量供應(yīng)受損，核糖體合成蛋白質(zhì)的活性下降，肝臟合成蛋白質(zhì)的能力進(jìn)而減弱[13]。而肝臟的損傷又會(huì)進(jìn)一步加劇血糖及脂肪代謝的紊亂。本研究結(jié)果表明，越橘花色苷對(duì)2型糖尿病小鼠肝臟的組織損傷具有一定的改善作用，可以減輕模型動(dòng)物肝臟組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及變性、水腫等，進(jìn)而可以修復(fù)肝臟功能。

綜上所述，藍(lán)莓花色苷能夠通過(guò)減輕實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病小鼠機(jī)體的氧化損傷，有效改善血糖代謝，并對(duì)糖尿病所致的肝臟損傷具有一定的保護(hù)作用，其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

[1]徐璐,鄭建仙.歐洲越橘花色苷的研究概況[J].中國(guó)食品添加劑, 2005(4): 43-64

[2]李穎暢,孟憲軍.藍(lán)莓葉黃酮提取物抗氧化活性的研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2008,30(4): 427-429

[3]楊桂霞,范海林,鄭毅男,等.篤斯越橘果實(shí)中黃酮類(lèi)化合物的分離鑒定[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,27(6):643－644

[4]魏健,關(guān)麗華,王秀華.紅豆越橘中化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J].北方園藝,2007(4):81－83

[5] KONG Jinming, CHIA L S, GOH N K, et al. Analysis and biological activities of anthocyanins[J]. Phytochemistry, 2003(64): 923-933

[6] Garzon G A, Narvaze C E, Riedl K M,et al. Chemical composition, anthocyanins,non anthocyanin phenolics and antioxidant activity of wild bilberry from Colombia[J]. Food Chem,2010,122(4):980－986

[7]朱文赫,徐俊杰,張巍,等.長(zhǎng)白山篤斯越橘中花色苷不同提取工藝的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2012,33(4):59-62

[8] Ceriello A. New insights on oxidative stress and diabetic compl ications may lead to a"causal" antioxidant therapy [J]. Diabetes Care, 2003, 26(5): 1589 -1596

[9] Sardesai VM. Role of antioxidants in health maintenance[J].Nutr Clin Pract, 1995, 10(1): 19-25

[10] Ceriello A, M ercuri F, Quagliaro L, et al. Detection of nitroty-rosine in the diabetic plasma: evidence of oxidative stress[J].Diabetologia, 2001, 44(7): 834-838

[11] Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance [J]. Trends in Plant Science, 2002, 7(9):405-410

[12] Barnham K J, Masters C L, Bush A I. Neurodegenerative Diseases And Oxidative Stress[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2004, 3 (3):205-214

[13]王蓉蓉,謝琳,吳曉燁,等.銀杏葉提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠肝臟的保護(hù)作用[J].中國(guó)病理生理雜志, 2007, 23(3):566-569

Protective Effect of Blueberry Anthocyanins on Oxidative Damage in Type 2 Diabetes Mice

LI Ya-wei，CHANG Sheng，WANG Li-ming，JIN Ying*
（Department of Pharmaceutical Chemistry，Jilin Medical College，Jilin 132013，Jilin，China）

Abstract：To investigate the antioxidant activity and the protective effect on liver of blueberry anthocyanins in type 2 diabetes mice. Type 2 diabetes mice model was induced by high-fat diet and small dose of alloxan. Fifty mices were separated into five groups：normal control group，model control group，positive control group（allox an），low-dose blueberry anthocyanins group（100 mg/kg·d）and high-dose blueberry anthocyanins group （200 mg/kg·d）. The positive control and blueberry anthocyanins group were administered once daily for 30 days. We detected the fasting blood sugar of mices，the level of glutathione peroxidase（GSH-PX），superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA），the morphological changes of liver tissues after 12 hours behind the last time administration. Compared with the control group，the fasting blood sugar of mice maintained a higher level in model control group（P<0.01），the activity of SOD and GSH-PX in blood serum and liver tissues decreased significantly（P<0.01）while MDA content increased obviously（P<0.01）. The liver cells in mice appeared pathological changes of denaturation，interstitial edema and inflammatory cell infiltration. Compared with the model control group，the blood sugar decreased obviously in positive control group（P<0.01）and blueberry anthocyanins group，the activity of SOD and GSH-PX increased（P<0.01）while MDA content decreased （P<0.01），the pathological changes of liver improved. Blueberry anthocyanins can relieve the oxidative damage of experimental type 2 diabetes mices，and had some protective effects on liver.

Key words：blueberry anthocyanins；type 2 diabetes mice；oxidative damage

收稿日期：2015-12-01

*通信作者:金瑛（1973—），女，教授，博士。

作者簡(jiǎn)介：李亞巍（1984—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：藥物化學(xué)。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21102055）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.002