藍莓花色苷對2型糖尿病小鼠氧化損傷的保護作用

李亞巍，昌盛，王黎明，金瑛（吉林醫藥學院藥物化學教研室，吉林吉林132013）

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藍莓花色苷對2型糖尿病小鼠氧化損傷的保護作用

李亞巍，昌盛，王黎明，金瑛*
（吉林醫藥學院藥物化學教研室，吉林吉林132013）

摘要：探討藍莓花色苷對2型糖尿病小鼠體內抗氧化活性影響及肝臟的保護作用。采用高脂飲食聯合小劑量四氧嘧啶誘導的方法建立小鼠2型糖尿病模型。50只小鼠分為正常對照組、模型組、陽性藥（吡格列酮）組、藍莓花色苷低劑量（100mg/kg·d）給藥組和藍莓花色苷高劑量（200mg/kg·d）給藥組。陽性藥及藍莓花色苷給藥組，每天灌胃給藥1次，連續給藥30 d。末次給藥12小時后，測定小鼠空腹血糖，血清中及肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，并觀察小鼠肝臟組織形態學改變。與對照相比，模型組小鼠空腹血糖維持較高水平（P<0.01），小鼠血清及肝臟組織中SOD、GSH-Px活性明顯下降（P<0.01），而MDA含量明顯升高（P<0.01），小鼠肝細胞出現變性、間質水腫及炎癥細胞浸潤病理變化。與模型組相比，陽性藥和藍莓花色苷給藥組小鼠血糖明顯降低（P<0.01），SOD和GSH-Px活性升高（P<0.01），MDA含量下降（P<0.01），肝臟病理變化有所改善。藍莓花色苷能夠通過減輕實驗性2型糖尿病小鼠機體的氧化損傷，并對肝臟損傷具有一定的保護作用。

關鍵詞：藍莓花色苷；2型糖尿病小鼠；氧化損傷

越橘（Bilberry），又稱藍漿果、藍莓果，屬于杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium.SPP），多年生落葉或常綠灌木[1-2]。藍莓果實橢圓形或偏球形，藍紫色，味道酸甜[3-4]，是我國重要的一種天然綠色野生資源，具有很高的營養價值。越橘中含有豐富的花色苷，花色苷是一種廣泛存在于植物中的功能性水溶色素，是一種天然的抗氧化劑，具有抗氧化、清除自由基等多種生理活性[5]。因此，其作為具有重要生理活性的天然著色劑，廣泛應用于食品、藥品行業。國內外對藍莓花色苷生理功能的研究主要集中在清除自由基作用、抗癌等方面，而其對體內生理活性影響的研究還很少[6]。

本研究將從越橘花色苷抗氧化及對肝臟損傷的保護作用方面，探討其改善糖代謝的相關機制，為藍莓花色苷功能食品的開發提供理論參考。

1　材料與儀器

1.1材料與試劑

長白山野生藍莓為8月份采收，于-80℃冰箱中保存備用，按參考文獻[7]方法，提取藍莓花色苷；高糖高脂飼料（蛋黃2.5 %、蔗糖20 %、豬油10 %、基礎飼料67.5 %）；四氧嘧啶：SIGMA公司；鹽酸吡格列酮片：江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；膽固醇（TC）測定試劑盒、甘油三酯（TG）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒：江蘇碧云天生物技術研究所。其他試劑均為國產分析純。

1.2主要儀器

550酶標儀：美國Bio-Rad公司；UV-4802型紫外可見分光光度計：上海UNICO儀器有限公司；TGL-16G臺式高速離心機：上海安亭科學儀器廠；OLYMPUS光學顯微鏡：日本奧林巴斯（中國）有限公司；MTN-658自動生化分析儀：長春市曼特諾醫療器械有限公司。

1.3試驗動物

選取健康成年KM種小鼠80只，雄性，體重18 g～ 20 g，購于吉林大學基礎醫學院醫學實驗動物中心，合格證號SCXK（吉）2008-0005。動物適應性喂養1周后開始實驗，室溫18℃～28℃，相對濕度62 %～80 %。

2　試驗方法

2.1動物前期飼養及處理

參考文獻[10]，建立2型糖尿病實驗動物模型，試驗期間，嚴格按照動物飼養管理標準和規范進行飼養。隨機選取出20只小鼠喂普通飼料，自由飲水，其余小鼠喂高糖高脂飼料，自由飲水。喂養8周后，兩組各隨機抽取4只小鼠禁食不禁水12 h，摘眼球取血，3 000 r/min離心5 min，取血清，進行血脂檢測，喂高糖高脂飼料的小鼠血清中TC、TG較對照組顯著升高（P< 0.01），表明高脂動物模型建模成功。取高脂模型小鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射小劑量四氧嘧啶（180 mg/kg）。72 h后，對小鼠進行尾尖取血，用血糖儀檢測小鼠空腹血糖（檢測前12 h禁食不禁水），以血糖值≥10 mmol/L為建立2型糖尿病模型標準，篩選造模成功動物。

2.2動物分組及處理

選取喂養普通飼料的小鼠10只作為正常對照組；2型糖尿病模型小鼠隨機分成4組，每組10只，分別為模型組、陽性對照組吡格列酮（100 mg/kg·d）、越橘花色苷高劑量組（200mg/kg·d）、越橘花色苷低劑量組（100 mg/kg·d）。灌胃給藥，0.1 mL/10 g體重，連續30 d，正常對照組給予等體積生理鹽水。除正常對照組外，其余各組繼續喂高糖高脂飼料。

2.3生化指標檢測

末次給藥后，動物禁食12 h采血，小鼠眼球取血，用全自動生化分析儀測定空腹血糖（FBG）。取血后小鼠立即采用頸椎脫臼處死，迅速取出肝臟，以冰冷生理鹽水清理血跡，吸干水分，準確稱量，并加入9倍無菌的冰冷生理鹽水手動制成10 %的心臟勻漿，離心（4 000 r/min，10 min），上清液置于-85℃冰箱待用。嚴格按照試劑盒說明書分別進行測定血清和肝臟組織中SOD活性、GXH-Px活性、MDA含量。SOD和GXHPx活性及MDA含量的測定方法按照試劑盒說明書進行，用分光光度計測定。

2.4肝臟織病理學檢查

小鼠處死后冰浴下立即取小鼠肝臟臟，固定于10 %福爾馬林溶液，病理切片常規石蠟包埋、切片、HE染色，觀察肝細胞變性及壞死，炎癥細胞浸潤，間質水腫，血管反應，纖維增生病理學變化。

2.5數據統計

實驗數據均以x±s表示，所有實驗數據均采用SPSS 13.0軟件處理，對照組與給藥各組比較進行單因素方差分析，以P≤0.05為差異有統計學意義。

3　試驗結果

3.1越橘花色苷對小鼠空腹血糖的影響

通過高脂飲食小劑量四氧嘧啶誘導的方法建立2型糖尿病模型，檢測藍莓花色苷對2型糖尿病小鼠的治療作用。結果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠空腹血糖維持在較高的水平（P<0.01）。而與模型組相比，陽性對照組和越橘花色苷給藥組空腹血糖呈現下降趨勢，結果見圖1。

圖1　越橘花色苷對小鼠血糖的影響Fig.1 Effect of Buleberry anthocyanidin on the blood sugar of mouse

3.2越橘花色苷對小鼠血清中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影響

越橘花色苷對小鼠血清中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影響見表1。

表1　越橘花色苷對小鼠血清中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影響Tabe 1 The effect of Buleberry anthocyanidin on the activity of SOD and GSH-Px and the conten of MDA in mouse serum

表1結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px酶活力明顯降低（P＜0.01），而MDA含量升高明顯（P＜0.01）。與模型組相比，陽性對照組及藍莓花色苷高劑量及低劑量防護組小鼠血清中SOD、GSHPx酶活力升高明顯（P＜0.01），而MDA含量降低明顯（P＜0.01）。

3.3越橘花色苷對小鼠肝臟中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影響

越橘花色苷對小鼠肝臟組織中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影響見表2。

表2結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠肝臟中SOD、GSH-Px酶活力明顯降低（P＜0.01），而MDA含量升高明顯（P＜0.01）。與模型組相比，陽性對照組及藍莓花色苷高劑量及低劑量防護組小鼠肝臟中SOD、GSHPx酶活力升高明顯（P＜0.01），而MDA含量降低明顯（P＜0.01）。由結果可以看出，越橘花色苷能夠顯著改善

表2　越橘花色苷對小鼠肝臟組織中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影響Tabe 2 The effect of Buleberry anthocyanidin on the activity of SOD and GSH-Px and the conten of MDA in mouse hepar

2型糖尿病小鼠肝臟內氧化應激水平，從而對糖代謝進行調節。

3.4越橘花色苷對2型糖尿病模型小鼠肝臟病理改變的影響

病理切片檢測表明，正常組小鼠肝臟組織中見個別肝細胞變性，其余肝細胞無變性壞死，偶見間質血管充血及炎癥細胞浸潤，未見間質水腫。與正常組相比，模型組小鼠肝臟組織中肝細胞變性、間質血管充血、間質水腫及炎癥細胞浸潤部分非常明顯；與模型組相比，陽性給藥組、越橘花色苷高劑量組和低劑量組小鼠肝臟組織中肝細胞變性、間質血管充血、間質水腫及炎癥細胞浸潤部分明顯較少，表明越橘花色苷對2型糖尿病小鼠肝臟組織損傷具有一定的改善作用，見圖2。

圖2　肝臟組織病理切片（400X）Fig.2 Pathological sections of liver tissues（400X）

4　討論

近年的研究表明，2型糖尿病是一種與氧化損傷密切相關的內分泌常見疾病，無論是2型糖尿病實驗動物還是患者體內，確實存在氧化損傷相關指標的改變，進行抗氧化治療能抑制或延緩2型糖尿病及其并發癥的發生發展[8-10]。目前，國內外對于藍莓的研究主要集中在抗氧化、抗癌等方面。但有關藍莓花色苷通過抗氧化改善糖代謝的研究報道很少。本實驗采用高脂飲食小劑量四氧嘧啶誘導的方法建立2型糖尿病模型，探討藍莓花色苷對對2型糖尿病的治療作用。

本實驗結果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠空腹血糖維持在較高的水平，而陽性對照組和越橘花色苷給藥組空腹血糖呈現下降趨勢，說明藍莓花色苷對2型糖尿病小鼠具有一定的治療作用。正常機體內自由基代謝維持動態平衡，是由于存在有效的自由基清除系統。最重要的有SOD和GSH-Px，二者聯合起來清除體內的氧自由基。在慢性高血糖狀態下SOD和GSH-Px等可發生非酶促糖基化反應，使其清除自由基的能力明顯下降，導致脂質過氧化的最終產物MDA生成增多[11]。可以間接反映機體內氧自由基的代謝狀況、組織細胞受自由基損傷的程度及脂質過氧化程度[12]。研究結果顯示，越橘花色苷能夠顯著提升2型糖尿病小鼠血清中SOD和GSH-Px的活力，降低其血清中MDA的含量，說明越橘花色苷能夠有效清楚體內活性氧自由基和脂質過氧化物，保護機體免受自由基的損傷。

近年研究發現，肝臟是物質代謝的重要器官，也是常見的糖尿病慢性損傷的靶器官之一，肝臟中存在大量的胰島素受體，當肝臟得不到滋養時，必然會使代謝所產生的有害物質積聚，進一步損傷肝細胞線粒體，使其能量供應受損，核糖體合成蛋白質的活性下降，肝臟合成蛋白質的能力進而減弱[13]。而肝臟的損傷又會進一步加劇血糖及脂肪代謝的紊亂。本研究結果表明，越橘花色苷對2型糖尿病小鼠肝臟的組織損傷具有一定的改善作用，可以減輕模型動物肝臟組織炎癥細胞浸潤及變性、水腫等，進而可以修復肝臟功能。

綜上所述，藍莓花色苷能夠通過減輕實驗性2型糖尿病小鼠機體的氧化損傷，有效改善血糖代謝，并對糖尿病所致的肝臟損傷具有一定的保護作用，其具體作用機制還需進一步研究。

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Protective Effect of Blueberry Anthocyanins on Oxidative Damage in Type 2 Diabetes Mice

LI Ya-wei，CHANG Sheng，WANG Li-ming，JIN Ying*
（Department of Pharmaceutical Chemistry，Jilin Medical College，Jilin 132013，Jilin，China）

Abstract：To investigate the antioxidant activity and the protective effect on liver of blueberry anthocyanins in type 2 diabetes mice. Type 2 diabetes mice model was induced by high-fat diet and small dose of alloxan. Fifty mices were separated into five groups：normal control group，model control group，positive control group（allox an），low-dose blueberry anthocyanins group（100 mg/kg·d）and high-dose blueberry anthocyanins group （200 mg/kg·d）. The positive control and blueberry anthocyanins group were administered once daily for 30 days. We detected the fasting blood sugar of mices，the level of glutathione peroxidase（GSH-PX），superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA），the morphological changes of liver tissues after 12 hours behind the last time administration. Compared with the control group，the fasting blood sugar of mice maintained a higher level in model control group（P<0.01），the activity of SOD and GSH-PX in blood serum and liver tissues decreased significantly（P<0.01）while MDA content increased obviously（P<0.01）. The liver cells in mice appeared pathological changes of denaturation，interstitial edema and inflammatory cell infiltration. Compared with the model control group，the blood sugar decreased obviously in positive control group（P<0.01）and blueberry anthocyanins group，the activity of SOD and GSH-PX increased（P<0.01）while MDA content decreased （P<0.01），the pathological changes of liver improved. Blueberry anthocyanins can relieve the oxidative damage of experimental type 2 diabetes mices，and had some protective effects on liver.

Key words：blueberry anthocyanins；type 2 diabetes mice；oxidative damage

收稿日期：2015-12-01

*通信作者:金瑛（1973—），女，教授，博士。

作者簡介：李亞巍（1984—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：藥物化學。

基金項目：國家自然科學基金資助項目（21102055）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.002