胸腺嘧啶-15N2的合成與表征

徐建飛，杜曉寧，王　偉，雷　雯，侯　捷

(上海化工研究院 同位素研究所，上海　200062)

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胸腺嘧啶-15N2的合成與表征

徐建飛，杜曉寧，王偉，雷雯，侯捷

(上海化工研究院 同位素研究所，上海200062)

摘要：以甲酸乙酯和丙酸乙酯為原料，在金屬鈉存在下縮合得到中間體2-甲酰丙酸乙酯，中間體在酸催化下與同位素尿素-(15)N2縮合，在甲醇鈉作用下環化反應得到胸腺嘧啶-(15)N2。合成方法操作簡單，工藝流程短，副產物少，收率可達80%，(15)N同位素豐度穩定。產物經HPLC、IR、MS、1H NMR和(13)C NMR表征，結果表明：產物化學純度>99%，(15)N同位素豐度>98 atom%。

關鍵詞：同位素；胸腺嘧啶；2-甲酰丙酸乙酯

胸腺嘧啶又稱5-甲基尿嘧啶，在藥物合成中應用較廣。胸腺嘧啶為DNA所需的4種基本堿基之一，具有一定的藥理作用，可以合成抗癌藥物胸腺嘧啶氮芥；與其他脫氧核糖核苷(如脫氧胞苷、脫氧鳥嘌呤核苷、脫氧腺苷)合用，能顯著促進傷口愈合[1]。以胸腺嘧啶為中間體可以合成一系列抗病毒藥物，如齊多夫定和司他夫定等[2-3]。

標記胸腺嘧啶及其核苷是研究脫氧核糖核酸(DNA)的生物合成、染色體的復制等生命活動的重要示蹤劑[4]。應用標記胸腺嘧啶摻入法測定細菌生長速率是真實反映細菌活性和功能的重要手段，能真實反映細菌生理狀態，并將此法應用于醫學領域[5]、水生微生物學[6]、土壤科學等領域[7]。標記胸腺嘧啶摻入法測T淋巴細胞增殖反應，是目前國內外測定機體細胞免疫功能水平的重要指標，廣泛應用于實驗與臨床免疫的研究工作[8]。

文獻報道的胸腺嘧啶合成路線主要有以下4種。(1) 以α-甲基氰乙酸為原料，在醋酐溶液中與尿素縮合，再經鉑或鈀催化加氫環合得到胸腺嘧啶[9]。(2) 以丙酸乙酯、甲酸乙酯、硫脲、雙氧水等為原料，經縮合、環合、氧化及中和4步反應，合成胸腺嘧啶產品，反應總收率達64.5%[10]。(3) 以丙酸乙酯、氯甲酸乙酯、苯甲酰氯等為原料，經縮合、氯化、氧化、酸化和環合5步反應，制備得到胸腺嘧啶[11]。(4) 以α-甲基丙烯酸為原料，經溴化和酰氯化制得中間體2,3-二溴-2-甲基-丙酰氯，中間體再與尿素縮合，然后在甲醇鈉的作用下環合得到胸腺嘧啶。以上各種方法均存在合成路線較長，操作不便等缺點，且部分方法中較難以引入同位素標記原料，造成目標產物胸腺嘧啶-15N2的合成困難。綜合以上方法，本研究擬以甲酸乙酯和丙酸乙酯為原料，在金屬鈉存在下縮合得到中間體2-甲酰丙酸乙酯，中間體在酸催化下與同位素尿素-15N2縮合，再在甲醇鈉作用下環化反應得到胸腺嘧啶-15N2。

1實驗部分

1.1主要儀器與裝置

7890B-7000C氣質聯用儀：美國安捷倫公司，配有EI離子源及Qualitative Analysis B.06.00色譜工作站；LC-MS 2020液質聯用儀：日本島津公司產品，配有電噴霧離子源(ESI)及Lab Solutions系統工作站；Magna-IR-550型紅外光譜儀：美國Nicolet產品，KBr壓片制樣；Bruker AV 400 MHz核磁共振：德國Bruker產品，配有超屏蔽超導磁體系統。

1.2主要材料與試劑

尿素-15N2：99.2 atom%15N，上海化工研究院研制；丙酸乙酯、甲酸乙酯：分析純，美國Sigma-Aldrich公司產品；胸腺嘧啶：標準品，美國AccuStandard公司產品；其余均為市售的國產分析純試劑。

1.3合成方法

胸腺嘧啶-15N2合成路線如圖1所示。

250 mL三口圓底燒瓶中加入溶劑無水乙醚，混合0.3 mol甲酸乙酯和0.2 mol丙酸乙酯。攪拌中加入0.2 mol金屬鈉，水浴10 ℃反應，N2保護。反應液逐漸變渾濁，顏色由乳白色變成微黃色，最終成橙黃色，反應時間為24 h。反應結束后，加水攪拌，用10 mol/L硫酸調節pH=5，用乙醚萃取，飽和氯化鈉水洗，無水硫酸鈉干燥，旋干后得到橙黃色透明液體2-甲酰丙酸乙酯[11-12]。

將50 mmol尿素-15N2和50 mL甲醇混合，加入40 mmol 2-甲酰丙酸乙酯和3 g濃鹽酸于三口燒瓶中，60 ℃攪拌反應。回流5 h后加入6 g甲醇鈉至反應液中，繼續60 ℃攪拌反應，反應4 h左右。用稀硫酸調節pH=5，結晶得到固體為黃色，加水溶解，活性炭脫色，冷卻結晶得無色固體胸腺嘧啶-15N2，收率為80%(以尿素-15N2計)。

圖1　胸腺嘧啶-15N2的合成路線Fig.1　Synthesis of thymine-15N2

2結果與討論

2.1合成條件

考慮到合成反應中影響因素較多，擬采用正交實驗法，對反應機理和單因素反應實驗進行研究，確定3個影響因素分別為：反應溫度(A)、反應時間(B)、尿素-15N2和2-甲酰丙酸乙酯的摩爾比(C)，并以產物的收率作為考核指標，因素與水平的選擇列于表1，正交實驗結果列于表2，方差分析列于表3。

由表2可以看出，各因素對胸腺嘧啶收率的影響次序由大到小為：尿素-15N2和2-甲酰丙酸乙酯的摩爾比(C)>反應時間(B)>反應溫度(A)。由表3可知，尿素-15N2和2-甲酰丙酸乙酯的摩爾比(C)對胸腺嘧啶收率有極顯著的影響，而其他2個因素對胸腺嘧啶收率的影響則有限。由正交實驗結果可知，反應的最優化條件是A3B2C2，即反應溫度為60 ℃，反應時間為5 h，尿素-15N2和2-甲酰丙酸乙酯的摩爾比1.2∶1。最優條件二次驗證實驗平均結果胸腺嘧啶收率為81%，與正交實驗的結論吻合。

表1　正交實驗的因素與水平

表2　L9(33)的正交實驗

表3　方差分析

2.2結構表征

2-甲酰丙酸乙酯：橙黃色液體，收率為95.8%。GC-MS：tR=5.3 min時，主峰為中間體2-甲酰丙酸乙酯(見圖2)；主峰EI-MSm/z：C6H10O3130.2[M]，102.2[M-C2H5+H]，85.2[M-C2H5-CH3+H]，56.2[M-C2H5-CH3-CHO+H]，分子離子峰與碎片峰與理論值相符(見圖3)。

胸腺嘧啶-15N2：無色固體，HPLC經外標法定量計算化學純度為99.1%(見圖4)。1H NMR (DMSO-D6，400 MHz) ，δ：1.75[s，3 H，CH3]，7.27 (s，1 H，CH)；13C NMR(DMSO-D6)，δ：11.72，107.66，137.63，151.46，164.87；ESI-MSm/z：129[M+H]+(見圖5)，經計算15N同位素豐度為98.5%。

圖2　2-甲酰丙酸乙酯的GC譜圖Fig.2　GC of ethyl 2-formylpropionate

圖3　2-甲酰丙酸乙酯的EI-MS譜圖Fig.3　EI-MS of ethyl 2-formylpropionate

圖4　胸腺嘧啶-15N2的HPLC譜圖Fig.4　HPLC of thymine-15N2

在紅外譜圖(見圖6)中，IR(KBr)，ν/cm-1： 3 199，3 062，2 927，1 729，1 677，1 440，1 207；解析為3 199、3 062 cm-1處為N-H的伸縮振動峰，在2 927 cm-1處為CH3的吸收特征峰，在1 927 cm-1處為CO伸縮振動峰，1 677、1 440 cm-1處為N-H的彎曲振動峰，1 201 cm-1處為C-H的彎曲振動峰。

圖5　胸腺嘧啶-15N2的MS譜圖Fig.5　MS of thymine-15N2

圖6　胸腺嘧啶-15N2的IR譜圖Fig.6　IR of thymine-15N2

3結論

以甲酸乙酯和丙酸乙酯為原料經兩步反應合成胸腺嘧啶-15N2，并用HPLC、IR、MS、1H NMR和13C NMR對最終產物進行表征，確定其結構、化學純度和同位素豐度。該方法制備目標產物路線簡潔、高效，得到的化合物為進一步研究同位素標記嘧啶衍生物提供參考。

參考文獻：

[2]Pathak T. Azidonucleosides: synthesis, reactions, and biological properties[J]. Chemical Reviews, 2002, 102(5): 1 623-1 667.

[3]Agrofoglio L A, Gillaizeau I, Saito Y. Palladium assisted routes to nucleosides[J]. Chemical Reviews, 2003, 103(5): 1 875-1 916.

[4]Denifl S, Sulzer P, Zappa F, et al. Isotope effects in dissociative electron attachment to the DNA base thymine[J]. International Journal of Mass Spectrometry, 2008, 277(1-3): 296-299.

[5]Fuhrman J A, Azam F. Bacteriop1ankton secondary production estimates for coastal waters of British-Columbia、Antarctica and California[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1980, 39(6): 1 085 -1 095.

[6]Peng A G, Huang Y, Qiu Y S, et a1. Study on bacterial production in the high latitude coastal waters Antarctica[J]. Journal of Xiamen University, 2005, 44(1): 85-89.

[7]趙燦燦，王偉. 氚標記胸腺嘧啶摻入法在土壤細菌生長速率研究中的應用[J]. 熱帶亞熱帶植物學報,2014,22(1):101-106.

Zhao Cancan, Wang Wei. Applications of tritiated incorporation in determination of bacterial growth rate[J]. Journal of Tropical and Subtropical Botany, 2014, 22(1): 101-106(in Chinese).

[8]傅穎媛，黃淑云. 氚標記胸腺嘧啶摻入法檢測患者T淋巴細胞增殖反應[J]. 江西醫學院學報, 1995,35(4):83.

Fu Yingyuan, Huang Shuyun. Tritiated thymidine incorporation assay in patients with T lymphocyte proliferation[J]. Acta Academiae Medicinae Jiangxi, 1995, 35(4): 83(in Chinese).

[9]Tsuyoshi E, Shinichiro I, Mitsuaki S. Method for producing uracil of Thymine: JP, 2001151761[P] . 2001-06-05.

[10]劉敏，張翠娥，李普瑞，等. 胸腺嘧啶合成改進[J]. 精細化工中間體,2009,39(5):41-43.

Liu Min, Zhang Cui’e, Li Purui, et al. Improvements on the synthesis of thymine[J]. Fine Chemical Intermediates, 2009, 39(5): 41-43(in Chinese).

[11]Seki K I, Ohkura K, Sanoki K, et al. New [11C]phosgene based synthesis of [11C]pyrimidines for positron emission tomography[J]. Heterocycles, 2009, 77(2): 1 307-1 321.

[12]郭翔海，閆弘毅. 胸腺嘧啶的合成工藝[J]. 石油化工,2009,38(11):1 215-1 218.

Guo Xianghai, Yan Hongyi. Synthesis of thymine[J]. Petrochemical Technology,2009, 38(11): 1 215-1 218(in Chinese).

Synthesis and Characterization of Thymine-15N2

XU Jian-fei, DU Xiao-ning, WANG Wei, LEI Wen, HOU Jie

(ResearchInstituteofIsotope,ShanghaiResearchInstituteofChemicalIndustry,Shanghai200062,China)

Abstract:A novel and mild synthesis method of thymine-(15)N2 was designed. Ethyl formate and ethyl propionate as raw materials, the intermediate ethyl 2-formylpropionate was condensed under sodium metal, the target compound thymine-(15)N2 was obtained by condensation with isotope urea -(15)N2 under acid catalysis. Synthesis route had the advantages of simple operation, short process flow and less side product. The yield was more than 80% and isotope (15)N abundance did not diluted. The product was characterized by HPLC, IR, MS,1H NMR and (13)C NMR. The chemical purity was more than 99% and (15)N enrichment was more than 98 atom%.

Key words：isotope; thymine; ethyl 2-formylpropionate

doi：10.7538/tws.2016.29.01.0053

中圖分類號：TL92+3

文獻標志碼：A

文章編號：1000-7512(2016)01-0053-05

作者簡介：徐建飛(1979—)，男，上海人，高級工程師，主要從事同位素標記化合物的合成研究

基金項目：國家科技部科技支撐計劃專項(2015BAK45B01)；上海市科委地方攻關計劃課題(14DZ0511800)

收稿日期：2015-08-13;修回日期：2015-09-17