利用骨髓間充質干細胞膜片原位構建“三明治”樣組織工程牙周膜的實驗研究

徐海春，王 偉，徐曉東▲

（1.上海市黃浦區半淞園社區衛生服務中心口腔科, 上海 200011；2.上海市同仁醫院口腔科, 上海 200336）

基礎研究

利用骨髓間充質干細胞膜片原位構建“三明治”樣組織工程牙周膜
的實驗研究

徐海春1，王 偉2，徐曉東2▲

（1.上海市黃浦區半淞園社區衛生服務中心口腔科, 上海 200011；2.上海市同仁醫院口腔科, 上海 200336）

目的 探討骨髓間充質干細胞（BMSCs）膜片與膠原膜構建的“三明治”樣結構植入體內后牙周膜的再生情況。方法 制備BMSCs細胞膜片，與膠原膜構建夾層結構復合于牙根表面，植入原位生長，分別于4w和12w取材，利用X片、HE和天狼星紅染色觀察牙周膜的再生情況。結果 相比單純膠原膜組和空白對照組，實驗組在牙根與牙槽骨間形成了清晰的軟組織間隙，且有類Sharpey’s纖維存在，即形成了功能性牙周膜。結論 細胞膜片-膠原膜-細胞膜片的“三明治”樣夾層結構可以較好地促進牙周膜再生。

骨髓間充質干細胞；細胞膜片；牙周膜再生

牙周病越來越成為嚴重威脅人類健康的常見口腔疾病。隨著干細胞和組織工程技術的日益成熟，如何利用牙周組織工程方法實現真正意義上的牙周組織修復，已成為近年來研究的熱點。牙周膜是圍繞牙根并連接牙根和牙槽骨的致密結締組織，脫離了牙周這種特殊環境，牙周膜既不能發揮正常的功能，也難以實現組織再生。本實驗利用雙層干細胞膜片與膠原膜三層材料構建組織工程牙周膜，結合牙根與牙槽骨之間的原位植入環境，嘗試原位牙周組織再生，為牙周膜的組織工程重建提供一個新的思路。

1 材 料 和 方 法

1.1 材 料

比格犬，雌雄不限（某醫學科學院實驗動物中心提供）；可吸收醫用膠原膜（某生物醫學工程研究所）；α-MEM 培養基（Gibco）；PBS緩沖液；2.5g/ L胰酶（ Amresco） ；青鏈霉素（Gibco）；胎牛血清（Gemini）；抗壞血酸（Amresco）；DMSO、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素（Sigma）；L-谷氨酰胺、異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；堿性磷酸酶試劑盒（Sigma）；75%乙醇；酶聯儀（BDSL）；倒置顯微鏡（Nikon）；CO2細胞培養箱（Thermo）；切片機（Leica）；展片機、烤片機（AIHUA）。

1.2 方 法

1.2.1 細胞膜片的制備：無菌條件下抽取比格犬的骨髓約5ml，加入1:1的PBS緩沖液混勻，用比重為1.063的Percoll密度梯度離心法分離犬BMSCs，并在體外進行培養擴增。取第3代犬BMSCs胰酶消化制成細胞懸液，充分離散，調整其細胞密度為1×106，均勻接種于100 mm培養皿，加入10 ml成膜誘導培養液（含50 μg/ml抗壞血酸和10%FBS的α-MEM），每3天換液，孵育10-14天后可見培養皿底部出現白色膜樣物質，邊緣卷曲，此即為成熟的犬BMSCs細胞膜片，備用。

1.2.2 動物實驗：

1.2.2.1 實驗分組：選用1歲的健康比格犬3只，體重約12 kg。將每只犬的上、下頜兩側的第一前臼齒，共計12顆牙隨機分為空白對照組、單純膠原膜組和實驗組。

1.2.2.2 動物手術過程：

1.2.2.2.1 實驗牙拔除：3%戊巴比妥鈉30 mg/kg后肢股靜脈注射麻醉動物，將其仰臥固定于手術臺，常規消毒鋪巾，分離牙齦，使用牙挺、牙鉗，按照常規拔牙方法，拔除實驗牙。

1.2.2.2.2 牙根預處理：磨除牙冠，拔髓針拔除牙髓，根管銼預備根管，生理鹽水沖洗根管，移入預冷PBS中，快速轉入超凈臺，無菌PBS反復沖洗，75%酒精棉球消毒牙根面，尖刀片刮除牙周膜，24% EDTA處理根面2 min，PBS沖洗3遍后自然干燥。

1.2.2.2.3 制備復合體：細胞刮刀沿培養皿邊緣小心分離膜片，用無菌鑷進行提拉、卷曲，剪取適當大小的膠原膜，復合于兩層細胞膜片之間，構成“三明治”結構，包裹于牙根表面。

1.2.2.2.4 牙再植手術：無菌條件下，用渦輪機擴大拔牙窩，大小適當，使復合體順利進入，且不脫落、移位。牙根就位得當，嚴密縫合牙齦，使牙根不暴露。

術后動物給予青霉素肌肉注射3 d，流質喂飼。

1.2.2.3 動物處死取材及組織學檢測：

1.2.2.3.1 取材：術后4 w 和12 w分別處死動物，取犬的上下頜骨，分段切取4 w和12 w的含實驗牙段頜骨，固定于4%多聚甲醛中。

1.2.2.3.2 組織學檢測：

1.2.2.3.2.1 HE染色：10%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣，常規脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，制備石蠟切片，常規HE染色

1.2.2.3.2.2 天狼星紅染色：二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化至水后，天青石藍液染色5-10min，蒸餾水洗，天狼星紅飽和苦味酸濃染15-30min，無水乙醇直接分化與脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，在偏振光下觀察新生牙周膜中的膠原纖維。

Ⅰ型膠原纖維：緊密排列，顯示很強的雙折光性，呈黃色或紅色的纖維；

Ⅱ型膠原纖維：顯示弱的雙折光，呈多種色彩的疏松網狀分布；

Ⅲ型膠原纖維：顯示弱的雙折光，呈綠色的細纖維；Ⅳ型膠原纖維：顯示弱的雙折光的基膜，呈淡黃色。

2 結 果

2.1 動物實驗大體過程

實驗中制備的細胞膜片具有較好的韌性，可以進行提拉、卷曲等（圖1A），利于后面實驗應用。細胞膜片成熟后與膠原膜復合構建細胞膜片-膠原膜-細胞膜片的“三明治”樣結構，細胞膜片可以緊密貼合于牙根表面（圖1B）。如圖1C可以看到利用常規拔牙技術順利拔除第一前臼齒，拔出后注意保持牙根的無菌狀態。在牙根原位植入的手術中，拔牙窩的預備大小直接影響復合體進入的順利程度，如圖1D就顯示了拔牙窩預備過小導致復合體散落的情況，所以這是需要不斷提高的操作步驟，也是實驗成功的關鍵所在。

圖1 . 動物實驗過程

2.2 放射學觀察

比格犬于術后12w進行放射學觀察，三組X片差異并不明顯：空白對照組根周影像模糊、稀疏（圖2A）；膠原膜組未見清晰的類似牙周膜影像（圖2B）；實驗組見愈合較好，類似牙周膜影像基本清晰（圖2C）。

圖2 . 術后12w X線片

2.3 組織學觀察

實驗組4w時牙周膜間隙內有大量平行纖維穿行，并見新生毛細血管（圖3C），12w時見有斜行的纖維插入牙骨質，似Sharpey’s纖維穿行（圖3F）；膠原膜組4w時似有牙周膜間隙形成，不規則纖維結締組織充填其中（圖3B），12w時不規則纖維結締組織增多，似有少量類牙骨質形成（圖3E）；空白對照組4w時不規則纖維結締組織剝離于牙根表面，只有少量附著（圖3A），12w時只有少量不規則纖維結締組織與牙根存在連結，并未附著于牙根表面，未見牙骨質（圖3D）。

圖3 . 組織學觀察（HE×200）

2.4 天狼星紅染色觀察

為進一步評價新生組織，本實驗進行了天狼星紅染色，在偏振光顯微鏡下觀察牙周膜纖維排列。實驗組4w時新生牙周膜中有Ⅰ型膠原（紅色）和較多Ⅲ型膠原（綠色，圖4C），12w時新生牙周膜主要為Ⅰ型膠原（紅色），斜行纖維插入牙骨質內，具有Sharpey’s纖維的特征（圖4F，圖5G）；膠原膜組通過偏振光顯微鏡觀察顯示類牙周膜纖維平行排列，不具有Sharpey’s纖維的特征（圖4B），12w時同時存在Ⅰ型膠原（紅色）和Ⅲ型膠原（綠色，圖4E）；空白對照組4w時見剝離狀態的纖維存在于牙根與牙槽骨間（圖4A），12w時少量纖維平行排列，主要是Ⅰ型膠原（紅色，圖4D）。

3 討 論

路[2-4]。

牙周疾病是引起牙周組織缺損，最終導致臨床牙齒缺失的常見原因。多年來，人們一直在尋求能有效增加牙周附著、重建牙周組織的治療方法。牙周骨移植、引導組織再生(guided tissue regeneration,GTR)技術為牙周病治療和牙周缺損修復帶來了希望，但在恢復牙周組織的生理結構和功能上還遠未達到所期望的目標[1]。而牙周組織工程技術的引入，為牙周組織再生研究提供了新的思

圖4 . 天狼星紅染色觀察（×200）

圖5 . 12w實驗組再生牙周膜的高倍鏡觀察（G×400）

BMSCs在合適的牙周微環境和適當的生物刺激因子的作用下可分化為牙骨質細胞和成骨細胞，被認為是牙周組織工程中一種較為理想的種子細胞[5], 且相比牙周膜細胞群具有來源豐富、取材簡單等優勢[6]，因此本實驗選用BMSCs作為種子細胞。傳統的將細胞懸液接種于支架材料植入牙周缺損處的方法細胞利用率較低，且會破壞形成的細胞外基質和細胞連接蛋白等[7]，而細胞膜片技術的出現解決了這些問題。但細胞膜片易收縮、卷曲，本實驗將支架材料與其復合使用，不僅對細胞膜片起著支持和保護作用，還可為牙周膜的重建提供一定的空間。

生理情況下，牙周再生的過程是成纖維細胞通過合成與降解膠原對牙周膜中的膠原纖維不斷改建，成骨細胞和成牙骨質細胞積聚形成牙骨質和牙槽骨，新形成的牙周膜纖維被埋在其中，進而完成對牙周組織的功能性重建[8]。此實驗中應用的膠原膜具有良好的力學強度和韌性，生物相容性好，作為組織再生的天然基質可直接參與愈合過程，對創面和血凝塊具有良好的保護作用，為其提供一個很好的再生環境。然后將細胞膜片與膠原膜聯合應用，互相彌補了不足，可以更好地促進牙周組織重建。另外Flores等[9]曾用不同層次的牙周膜細胞膜片修復裸鼠牙周缺損，發現三層細胞膜片修復效果更為理想。本實驗設計成細胞膜片-膠原膜-細胞膜片的“三明治”樣夾層結構，間接增加了細胞膜片厚度，使其與牙根表面貼附更為緊密，更利于牙周膜的形成，進一步證明了該方法的先進性和有效性。本實驗中使用膠原膜單獨植回原位，只是阻擋了上皮細胞下行生長，對牙周組織再生僅僅提供生物誘導作用[10]，通過HE染色可以發現，實驗組在牙周膜間隙內有大量斜行纖維，膠原膜組僅見不規則排列的纖維結締組織，空白對照組中幾乎沒有或僅觀察到少量纖維結締組織。從放射學觀察也發現實驗組愈合得最好，有較清晰的牙周膜影像。證明BMSCs細胞膜片夾層結構具有更好的促進牙周膜再生的效果。

實現牙周組織再生的關鍵是功能性的牙周纖維（Sharpey’s纖維）斜行插入新生的牙骨質。為了更好地觀察牙周纖維的走向，本實驗利用偏振光顯微鏡觀察天狼星紅染色標本，實驗組可看到多數膠原纖維斜行插入新生牙骨質，膠原膜組牙周纖維束多平行于牙根表面，空白對照組再生纖維量少且平行于牙根表面。這提示BMSCs細胞膜片夾層結構實現了真正的再生，可以正常行使咀嚼功能。

總之，本實驗所使用的細胞膜片技術保持了細胞最佳的生物學活性，與支架聯合應用，互相揚長避短，使其具備更好的機械性能，利于移植細胞較好地貼附于牙根表面，能夠較好的誘導牙周膜再生。

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Periodontal Regeneration on the Surface of Tooth Root Using BMSCs Sheet Combined with a Sandwich Structure：a Canine Model in Situ

XU Haichun1，WANG Wei2，XU Xiaodong2
(1. Department of Stomatolugy,Bansong Community Health Centre of Huangpu District, Shanghai City, 200011,China; 2. Department of Stomatolugy,Shanghai Tongren Hospital, Shanghai City, 200336,China)

Objective To probe the periodontal ligament regeneration effect of implantation of bone marrow mesenchymal cells（BMSCs）sheet -collagen membrane-BMSCs sheet sandwich complex. Methods BMSCs cell sheet-collagen membrane-BMSCs sheet complexes were compounded on the root surface. All dogs were killed on 4 weeks and 12 weeks after implantation. The periodontal ligament regeneration were observed in radiological means ,HE staining and Sirus-red staining. Results Compared with collagen membrane group and blank control group,there was a clearly periodontal ligament like tissue and Sharpey’s like fibres formation only in test group. Conclustion Cell sheet-collagen membrane-cell sheet sandwich complex can preferably improve the periodontal ligament regeneration.

bone marrow mesenchymal stem cell；cell sheet；extracellular matrix；tissue engineering

徐海春（1978-），女，江蘇南京人，本科，主治醫師。

徐曉東（1974-），男，浙江鄞縣人，本科，副主任醫師。