利福平和異煙肼耐藥基因突變快速檢測方法在結核病中的應用

辛寶林　于秀坤

【摘要】 目的 探討利福平和異煙肼耐藥基因突變采用PCR線性雜交酶顯色法建立快速檢測方法的應用價值。方法 88份送檢的結核病患者臨床標本， 得結核分枝桿菌分離株64株， 采用PCR線性雜交酶顯色法建立利福平和異煙肼耐藥基因突變快速檢測方法進行檢測， 同時采用比例法檢測， 并以比例法為標準評價快速檢測方法的診斷價值。結果 快速檢測方法中對利福平耐藥24份， 僅對異煙肼耐藥24份， 對利福平和異煙肼均耐藥22份， 不耐藥18份。以耐藥不耐藥作為分割點， 比例法藥敏試驗結果為參考標準， 快速檢測方法的靈敏度100.0%， 特異度90.0%， 準確度97.7%；兩種檢驗方法一致性好（P>0.05）。結論 PCR線性雜交酶顯色法建立快速檢測方法可在12 h內對利福平和異煙肼耐藥基因突變的作出判斷， 與比例法藥敏試驗一致性好， 可信度高， 值得臨床推廣。

【關鍵詞】 利福平；異煙肼；耐藥；基因突變；結核分枝桿菌；快速檢測

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.09.115

利福平和異煙肼是結核病的最重要的一線抗結核藥物[1]。近年來結核分枝桿菌基因突變發生耐藥的情況也時有發生， 世界衛生組織報道每年有新增48.9萬例耐多藥結核病， 其總量占結核病患者的4.8%， 而在我國則更為嚴重。耐多藥結核病的早期確診有利于患者的病情控制， 比例法藥敏試驗雖然結果可靠， 且被公認為判斷結核分枝桿菌耐藥的金標準， 但該方法需要細菌培養， 耗時2～4個月， 易貽誤病情。隨著分子生物學的飛速發展， 為結核分枝桿菌耐藥性快速檢測提供可能。本中心采用PCR線性雜交酶顯色法建立利福平和異煙肼耐藥基因突變快速檢測方法對送檢的疑似耐藥結核病患者臨床標本進行檢測， 并將結果與比例法藥敏試驗進行分析， 現報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 取2013年10月～2015年5月送檢的疑似耐藥結核病患者臨床標本88份， 其中痰65份， 肺泡灌洗23份。

1. 2 去污染處理 將1～2倍于痰及肺泡灌洗液樣本的4%NaOH放置于樣本中， 震蕩混勻， 靜置20 min， 再將pH=6.8的磷酸緩沖液加入樣本中， 3000 r/min離心1 min， 沉淀后去除上清液， 將1 ml磷酸緩沖液加入其中， 混勻， 獲得去污染樣本。

1. 3 方法

1. 3. 1 比例法藥敏試驗 取適量去污染樣本在酸性固體羅氏培養基上接種， 在37℃溫度下培養7 d， 菌群鑒定采用齊-尼氏染色法， 共得結核分枝桿菌分離株64株。制備10-2 g/L和10-4 g/L菌懸液， 各取0.01 ml采用劃線法接種在含藥培養基及對照培養基表面， 37℃溫度下培養4周， ≤1%為敏感。

1. 3. 2 快速檢測方法的建立 采用PCR線性雜交酶顯色法建立快速檢測方法。取去污染樣本500 μl加入1.5 ml離心管， 以5600 r/min的速度離心15 min后去上清液， 加入去離子水500 μl， 再次以5600 r/min的速度離心15 min， 沸水浴20 min， 超聲裂解15 min， 取上清液5 μl為DNA模板。采用BLAST軟件對katG、inhA和rpoB基因合適的擴增區域進行引物擴增， 其中katG基因2個探針， inhA基因2個探針， rpoB基因11個探針。PCR擴增體系（引物1 μl， 2.5 mmol/L三磷酸脫氧核糖核苷混合物4 μl， 10×PCR緩沖液5 μl， MgCl2 3 μl， DNA聚合酶5.0 U， 去離子水3 μl， 提取的DNA模板5 μl）進行PCR擴增。擴增條件：第一階段：95℃ 15 min， 95℃ 30 s， 58℃ 2 min， 10個循環；第二階段：95℃ 25 s， 53℃ 40 s， 70℃ 40 s， 30個循環；第三階段：70℃ 8 min。取20 μl PCR擴增產物加入雜交盤中， 與20 μl變性裂解液混勻， 室溫靜置5 min后， 加入1 ml雜交緩沖液， 放入探針試條。將雜交盤放入GTblot-20全自動雜交儀， 雜交成功后取出試紙吸水紙干燥， 判讀。

1. 4 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件處理數據。計數資料以率（%）表示， 采用χ2 檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

比例法藥敏試驗中僅對利福平耐藥26份， 僅對異煙肼耐藥23份， 對利福平和異煙肼均耐藥19份， 不耐藥20份。快速檢測方法中對利福平耐藥24份， 僅對異煙肼耐藥24份， 對利福平和異煙肼均耐藥22份， 不耐藥18份。以耐藥不耐藥作為分割點， 比例法藥敏試驗結果為參考標準， 快速檢測方法的靈敏度100.0%（68/68）， 特異度90.0%（18/20）， 準確度97.7%（86/88）， 兩種檢驗方法一致性好（P=0.1573>0.05）。

3 討論

目前， 基于分子生物學研究的利福平和異煙肼耐藥基因突變快速檢測方法包括實時PCR單鏈構象多態性分析、實時PCR熔解曲線法、噬菌體法、基因芯片法及PCR線性雜交酶顯色法等， 后兩種方法應用最為廣泛。這些方法預測耐藥表型均基于結核分枝桿菌的rpoB、katG和inhA基因特定區域或位點突變[2]。約96%的利福平耐藥性與rpoB突變相關， 30%～60%的異煙肼耐藥性與katG基因突變相關， 故上述基因區域可基本覆蓋耐藥基因突變情況， 為檢測技術的靈敏度和準確性提供保障。PCR線性雜交酶顯色法也可見于慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥研究[3]。該技術應用于結核分枝桿菌的檢測時， 通過多重聚合酶鏈反應結合反向雜交技術， 與固定在硝化纖維條帶上的特異基因雜交[4]， 顯色判讀。在此過程中PCR擴增效果不受細菌存活量的影響、雜交后化學信號放大， 是PCR線性雜交酶顯色法的靈敏度高的主要原因。本研究結果顯示快速檢測方法的靈敏度100.0%， 特異度90.0%， 準確度97.7%， 結果與李大登等[5]報道一致。本研究納入為疑似耐藥結核病患者， 故耐藥陽性檢出率為77.27%（68/88）， 遠高于其他報道的總耐藥率29.14%[6]， 符合事實。此外， 與比例法藥敏試驗相比， PCR線性雜交酶顯色法成本更低， 更利于在地市級結核病醫院實驗室應用[7]。另外本研究中PCR線性雜交酶顯色法整個操作過程≤6 h， 可做到當天送檢當天出結果， 符合快速檢測的要求。

綜上所述， 采用PCR線性雜交酶顯色法建立利福平和異煙肼耐藥基因突變快速檢測方法進行檢測， 與比例法藥敏試驗一致性好， 可信度高， 值得臨床推廣。

參考文獻

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[收稿日期：2015-11-09]