胱氨酸鈉改性TiO2薄膜及其抗血小板激活行為研究*

王　宏，范永鴻，韓鴻紅，潘夏鑫，翁亞軍，黃　楠

(1. 西南交通大學 生命科學與工程學院， 成都 610031；

2. 西南交通大學 材料科學與工程學院，材料先進技術教育部重點實驗室， 成都 610031)

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胱氨酸鈉改性TiO2薄膜及其抗血小板激活行為研究*

王宏1,2，范永鴻2，韓鴻紅2，潘夏鑫2，翁亞軍2，黃楠2

(1. 西南交通大學 生命科學與工程學院， 成都 610031；

2. 西南交通大學 材料科學與工程學院，材料先進技術教育部重點實驗室， 成都 610031)

摘要：生物材料表面固定催化活性分子，催化內源性供體釋放一氧化氮(NO)，能顯著改善材料表面的血液相容性。通過聚多巴胺作為中間連接層，在TiO2薄膜表面固定不同手性的L-型或D-型胱氨酸鈉獲得催化活性表面，研究固定不同手性胱氨酸鈉表面對改善血小板激活行為的影響。X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)和水接觸角檢測結果顯示，在相同工藝條件下表面固定L-型或D-型胱氨酸鈉后物理化學性質相近，而兩種表面的生物學性質卻存在較大差異，固定D-型表面預先吸附白蛋白后表面親水性略有增加但標準偏差較大，而固定L-型表面催化釋放NO的能力和抗血小板的激活性能均優于固定D-型表面。

關鍵詞：TiO2薄膜；胱氨酸鈉；手性；NO；血小板激活

0引言

無機TiO2薄膜具有抑制有毒金屬離子釋放和較好的抗凝血惰性等優點，在心血管材料表面改性研究領域引起了廣泛的關注[1-2]。研究顯示，通過進一步在TiO2薄膜表面接枝生物活性功能分子，可以顯著提高其抗凝血性能或細胞相容性[3-4]。

一氧化氮(NO)是內皮細胞分泌的重要信號分子，釋放NO的生物材料顯示出優異的抗凝血和抗平滑肌增生性能。其中NO催化釋放型材料將催化活性成分固定在材料表面，當與人體血漿接觸時，由于人體中存在穩定的內源性NO供體，將催化產生NO[5-7]。例如，將含有二硫鍵的小分子胱胺固定在TiO2薄膜能夠催化釋放內源性NO供體釋放NO，顯著改善表面的抗血小板激活和粘附性能[8-10]。這類材料不受NO儲存量的限制，具有較大的應用前景。本文選擇胱氨酸鈉作為催化活性分子，通過聚多巴胺作為中間連接層[11]將其固定在TiO2薄膜表面構建表面催化活性,原位催化內源性供體釋放NO。

由于胱氨酸鈉是手性分子，固定L-型和D-型胱氨酸鈉的表面可能具有不同的生物學性能。生物體系中的蛋白質、糖類均具有手性特征，在藥學研究領域已經證實不同手性特征的藥物其生物學效能往往大不相同[12-13]。生物材料研究領域的研究結果也同樣顯示，表面成分相同，物理化學性質相似的表面，由于表面手性構型不同，顯示出了不同的蛋白吸附能力和細胞相容性[14-15]，因此本文擬開展固定L-型和D-型胱氨酸鈉TiO2薄膜的抗血小板激活行為研究。

1實驗

1.1胱氨酸鈉改性TiO2薄膜的制備

采用UBMS450高真空非平衡磁控濺射設備，在單晶硅表面沉積TiO2薄膜，所制備的TiO2薄膜為銳鈦礦晶型結構，標記為Ti-O。配制pH值=8.5的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液，加適量多巴胺溶解后使其濃度為2 mg/mL。37 ℃條件下將TiO2薄膜樣品浸入上述多巴胺溶液中24 h，用蒸餾水超聲清洗后得到沉積1層聚多巴胺的樣品，重復上述操作4次得到沉積5層聚多巴胺層的樣品，標記為Dop。配制6 mmol/L 的NaOH溶液，用此NaOH溶液分別溶解L-胱氨酸、D-胱氨酸(購自Sigma-aldrich公司)后制得終濃度為3 mmol/L的L-胱氨酸鈉和D-胱氨酸鈉溶液。將樣品Dop分別浸泡在上述L-胱氨酸鈉和D-胱氨酸鈉溶液中反應24 h，清洗后得到表面接枝了L-胱氨酸鈉或D-胱氨酸鈉的樣品，分別標記為L、D。

1.2XPS分析

XSAM800型X射線光電子能譜儀(英國KRATOS),分析條件為單色AlKα，工作電壓10～20 kV，發射電流45 mA，光子能量為1 486.6 eV，以C1s(結合能EB=284.6 eV)校正結合能值。

1.3水接觸角分析

用躺滴法測量樣品表面的水接觸角，測試儀器為DSA100型接觸角測量儀(KRüSS, Germany)，結果為12個測試點的平均值。

表面吸附白蛋白后水接觸角檢測方法：配置0.5 mg/mL白蛋白溶液，將樣品L、D分別浸入上述溶液中浸泡2 h，取出用蒸餾水清洗，真空干燥后用DSA100型接觸角測量儀檢測表面的親水性。

1.4催化釋放NO檢測

采用Sievers 280i型NO化學發光檢測儀(美國)檢測樣品催化釋放NO。檢測條件：N2作為載氣，溫度37 ℃，壓強1 399.88 Pa，內源性供體溶液中GSH濃度為30 μmol/L，GSNO濃度為32.5 μmol/L，實驗樣品大小為0.8 cm×0.4 cm。

實驗方法：將樣品用細絲懸掛在玻璃反應器中，向反應器中加入內源性供體溶液，待基線穩定后將樣品完全浸入溶液中,反應生成的NO通過N2氣帶入檢測器進行檢測。

1.5體外血小板粘附實驗

由于體外實驗會不斷消耗內源性供體，而不能像體內那樣自動補充，因此體外血小板實驗時采取了添加內源性NO供體GSNO和GSH的方法。將樣品置于24孔培養板中，每個樣品上加入0.5 mL包含內源性供體的PRP，使內源性供體中GSNO濃度為65 μmol/L，GSH為30 μmol/L，37 ℃恒溫水浴中避光孵化30 min。實驗分為膠原組和非膠原組，膠原組中每個樣品所在的24孔板中加入了膠原，其終濃度為0.06 mg/mL。

粘附血小板的熒光染色：用PBS清洗血小板粘附實驗后的樣品3次，避光條件下向每個樣品表面滴加50 μL羅丹明熒光染料， 37 ℃避光保溫15 min，然后用PBS洗去多余的熒光染料，晾干后用Leica熒光顯微鏡(Leica,Germany)進行拍照觀察。

2結果與討論

2.1XPS分析

圖1所示為L-胱氨酸鈉改性樣品各層次的XPS檢測結果。

圖1固定L-胱氨酸鈉各層次樣品表面不同修飾層XPS圖譜

Fig 1 XPS spectra of samples of each step modified by L-cystine (sodium salt)

從圖1可知，相對于Ti-O樣品，Dop樣品表面出現了N1s的峰，說明多巴胺成功引入到氧化鈦薄膜表面，而L樣品表面相對Dop樣品新出現了S2s(229 eV)和S2p(165 eV)峰，說明L-胱氨酸鈉成功接枝到樣品表面。固定D-胱氨酸鈉系列樣品的XPS全譜與L系列樣品相似，因此不再贅述。

圖2為固定不同手性胱氨酸鈉樣品上S元素的XPS高分辨圖譜。通過樣品L和D表面N、O、C和S各元素高分辨譜的峰面積積分和靈敏度因子，計算出樣品L和D表面S元素的含量分別為1.4%和1.3%，表明在樣品L和D表面固定的不同手性的胱氨酸鈉含量幾乎一致。

圖2　樣品L、D表面的S高分辨圖譜

Fig 2 High resolution XPS spectra of sample L and sample D

2.2水接觸角分析

圖3為各樣品的水接觸角結果。樣品上引入聚多巴胺后表面的水接觸角明顯降低，可能是聚多巴胺中含有大量的親水性基團氨基和醌基的緣故。固定L-胱氨酸鈉與D-胱氨酸鈉樣品表面的親水性沒有差別，然而吸附白蛋白后，兩種表面的親疏水性出現了明顯的差別，D樣品表面的親水性略有增加，但多次實驗結果顯示D樣品表面水接觸角的標準偏差較大，說明D樣品吸附白蛋白后表面的親疏水性很不均勻，可能是D樣品上吸附白蛋白的親水區域和疏水區域暴露不均一所造成，深入的機制還需要進一步的研究。

圖3　各樣品的水接觸角

2.3催化釋放NO檢測

化學發光方法檢測NO釋放的結果如圖4所示。

圖4樣品L、D催化釋放NO檢測結果

Fig 4 Results of NO release catalyzed by sample L and sample D

待基線穩定后將樣品浸入供體溶液中，結果顯示固定了胱氨酸鈉的樣品均具有催化釋放NO的功能。NO平穩釋放，沒有突釋，圖4中出現的尖峰是由拉下懸掛的樣品時所造成的氣體擾動所致。在供體溶液濃度和測試樣品大小完全一致的條件下，結果顯示L-型樣品催化釋放NO的速度明顯增加。

2.4體外血小板粘附結果

膠原是血小板的激活劑，心血管器械在植入過程中難免會損傷內膜，暴露出下層膠原，因此本文考查了在膠原存在條件下，各樣品表面血小板的粘附情況。結果如圖5所示，膠原存在時表面粘附的血小板完全攤開，內容物釋放，血小板激活程度最高，聚多巴胺表面由于具有醌基，因此具有一定的催化釋放NO功能[16]，其表面的血小板激活其次，樣品L表面血小板的激活程度最低，血小板鋪展最小。

圖5　樣品表面血小板粘附后的照片(膠原組)

未加膠原組血小板粘附后的照片(圖6)也清楚地顯示L樣品表面粘附血小板的激活程度明顯優于D樣品上血小板的情況。

圖6　樣品表面體外血小板粘附后的照片(無膠原組)

3結論

(1)通過多巴胺過渡層成功將目標分子胱氨酸鈉固定到TiO2薄膜表面，固定不同手性胱氨酸鈉的表面S元素含量，表面親水性相似，但預吸附白蛋白后表面的親疏水性表現出明顯不同，D-表面親水性略有增加但不均勻。

(2)固定胱氨酸鈉的表面能夠催化內源性供體GSNO釋放NO，而固定L型胱氨酸鈉的表面相對D-型表面具有更大的催化活性。

(3)固定胱氨酸鈉的樣品通過催化釋放NO，顯著抑制了膠原對血小板的激活，固定L-胱氨酸鈉的樣品具有更強的抑制血小板激活功能。

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Study of cystine sodium immobilization and anti-platelet activation on TiO2film

WANG Hong1,2, FAN Yonghong2, HAN Honghong2, PAN Xiaxin2,WENG Yajun2, HUANG Nan2

(1.School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China;2.Key Laboratory for Advanced Technologies of Materials, Ministry of Education,School of Materials Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China)

Abstract:It is acknowledged that NO releasing by degradation of endogenous NO donor catalyzed by biomaterials can significantly improve blood compatibility of the surfaces. And D-cystinesodium, a poly-dopamine coating was used to as a linker to immobilize cystine sodium with different chirality such as L-cystinesodium on TiO2 films to construct catalytic activity. The effect of immobilizing cystine sodium with different chirality on anti-platelet activation was analyzed. The X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and the water contact angle test results showed that, in the same preparation process, the surfaces with either L-cystinesodium or D-cystinesodium immobilization have similar physical and chemical properties, while there are different biological properties of the two kinds of thesurfaces.Surfaces with D-cysteine sodium immobilization show higher hydrophilicproperties with higher standard error after pre-adsorption of BSA, while surfaces with L-type immobilization show higher NO release by catalyzing endogenous NO and enhancement of anti-platelet activation ability in vitro.

Key words:TiO2 films; cystine sodium; chirality; nitric oxide; platelet adhesion

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.02.002

文獻標識碼：A

中圖分類號：R318.08

作者簡介：王宏(1989-)，女，山東煙臺人，碩士，師承翁亞軍副教授和黃楠教授，從事生物材料表面功能化研究。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31270020)；中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(2682014CX006)；四川省青年基金資助項目(2013JQ0043)

文章編號：1001-9731(2016)02-02006-04

收到初稿日期：2015-02-24 收到修改稿日期：2015-06-19 通訊作者：翁亞軍，E-mail：wengyj7032@swjtu.edu.cn