斑馬魚中snrpc基因的發育時序表達分析

摘 要：為了深入研究魚類snrpc基因的作用機制，通過分析斑馬魚snrpc的發育時序表達，來探討snrpc基因在斑馬魚中的功能機理。從斑馬魚的胚胎中提取RNA，進行反轉錄、PCR、克隆等，得到snrpc基因在胚胎發育不同時期的表達水平。結果表明，在斑馬魚胚胎發育初期，snrpc表達量較高，隨著胚胎的不斷發育，snrpc的mRNA表達量有所下降，到后期表達量又上升。因此，snrpc表達量的變化可能預示著snrpc發揮功能的關鍵時期，對snrpc的克隆和表達分析，為后續進一步研究其相關功能奠定了基礎。

關鍵詞：斑馬魚；時序表達；snrpc

中圖分類號 S965.299 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）08-14-02

Abstract：In order to further study the mechanism of snrpc in fish，we analysed the temporal expression of snrpc to explore the potential function of snrpc gene in zebrafish.In this study，the total RNA was extracted from zebrafish embryos，then cDNA was synthesized by reverse transcription. The snrpc gene was amplified successfully by PCR. The temporal expression pattems of ssnrpc among embryonic development were analyzed by RT-PCR. Results showed that the snrpc mRNA were mainly transcribed in the initial development of zebrafish embryos. With the embryonic development，the snrpc mRNA decreased.In the late stages of embryonic development，the mRNA rise again. Therefore，the changes may indicate that high mRNA level stages are the key periods. The cloning and expression characterization of snrpc laid the foundation for the further study of gene function.

Key words：Zebrafish；Temporal expression；Snrpc

snRNP蛋白在mRNA前體剪切中發揮著重要的功能[1-2]。本實驗室在斑馬魚卵巢文庫中擴增到一種snrpc基因。研究證明在兩棲類的卵細胞中發現有SNRPC蛋白，但在魚類中，僅在鯽魚中有報道，但未作深入研究[3-5]，在魚類中SNRPC蛋白如何發揮功能仍是未知數。在本研究中，通過分析斑馬魚snrpc的發育時序表達，來探討其在斑馬魚發育過程中的功能機理，以期填補這方面研究的空白。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 斑馬魚的胚胎培養 斑馬魚（Danio rerio）置于（28±1）℃的水循環系統中進行養殖。

1.1.2 主要儀器設備 Sequi-Gen電泳儀系統，Bio-RabGONGSI公司；PCR儀，Bio-RabGONGSI公司；定量移液器，法國Glison公司；Bio-RabGONG-SI公司，凝膠成像系統，高速冷凍離心機；隔水式恒溫培養箱，上海精宏實驗公司；超凈工作臺；低溫水浴鍋；恒溫水浴鍋；恒溫搖床，上海精宏實驗公司。

1.1.3 主要試劑 PCR taq酶，TaKaRa公司；限制性內切酶，NEB公司；PCR純化試劑盒、質粒提取試劑盒、酶切膠回收試劑盒，上海生工；T4連接酶購，Promega；KOD kit，TOYOBO。

1.2 實驗方法

1.2.1 斑馬魚snrpc的克隆 （1）RNA的提取；（2）mRNA逆轉錄成cDNA；（3）PCR擴增目的基因snrpc。

將PCR的產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將與預期一致的條帶回收，連接、轉化及陽性克隆鑒定。

1.2.2 mRNA表達水平檢測

1.2.2.1 各個時期胚胎RNA的提取和cDNA的合成 和前面總RNA的提取和反轉錄合成第一鏈cDNA的方法一樣，各個時期的胚胎各取50～100mg。

1.2.2.2 RT-PCR檢測mRNA水平 RT-PCR中用到的引物如下：

2 結果與分析

2.1 snrpc基因克隆的結果及序列分析 用oligo dT引物逆轉錄合成mRNA的第一鏈cDNA。根據NCBI上預測的snrpc的全基因序列，設計引物，以第一鏈cDNA為模板PCR擴增snrpcc的ORF序列，得到與預期大小一致的條帶（如圖1）。由圖1可知，在500bp與250bp之間的400bp處存在較亮條帶與目的DNA條帶大小相符，擴增片段正確。回收后，將該片段連接到pGEM-T vector上，轉化到大腸桿菌JM109中，挑取單克隆，通過菌液PCR鑒定陽性克隆，測序結果顯示與預期一致。snrpc的cDNA全長為398bp，包含3個部分，一個282bp的開放閱讀框（ORF），編碼94個氨基酸，長度為52bp的5′非編碼區（5′-UTR，5′-untranslated region），長度為64bp的3′非編碼區（3′-UTR，3′-untranslated region），有一個多聚腺苷酸加尾信號AATAA和一個多聚腺苷酸尾巴。

2.2 snrpc在胚胎發育不同時期的mRNA水平 為了進一步探究snrpc在斑馬魚胚胎發育各時期中所發揮的作用，本節中通過RT-PCR反應研究了在斑馬魚胚胎發育不同時期mRNA水平（如圖2）。首先提取了不同發育時期胚胎的總RNA，通過mRNA逆轉錄合成cDNA，β-actin作為內參，以cDNA為模板，用β-actin引物進行PCR反應，確保提取的各時期RNA的逆轉錄效率大體一致，再以snrpc的引物進行PCR擴增，通過電泳檢測，反應出胚胎發育各時期mRNA的表達量。

如圖2，通過RT-PCR，檢測到snrpc在斑馬魚早期不同胚胎發育時期的表達情況。結果顯示，斑馬魚snrpc從受精后0h開始有表達，且表達量較高，在4hpf開始表達量降低，隨后的6～9hpf表達量最低，基本檢測不到。12hpf時短暫升高，之后的12～24hpf表達量再次降低，從36hpf之后表達量再次升高并維持在相對較高并穩定的水平。因此，斑馬魚snrpc為母源性基因，且在早期胚胎發育過程中呈現動態表達。

3 討論

為了研究snrpc基因在斑馬魚中發揮的功能，克隆得到了snrpc基因的ORF序列。通過RT-PCR研究結果表明，snrpc mRNA在斑馬魚不同發育時期的表達情況則都呈現出一個動態變化的過程，在斑馬魚胚胎發育初期，snrpc表達量較高，可能參與了此階段的mRNA前體的剪切加工。隨著胚胎的不斷發育，snrpc的mRNA表達量有所下降，受精后6～9h完全檢測不到，這說明母源基因的耗盡。到后期表達量又上升，尤其是12h含量很高，說明snrpc很可能在這個時期發揮重要作用。同時這也說明對snrpc的表達調節是一個多層次、多方面的調控過程，確保snrpc在斑馬魚生長發育過程中的精確表達。

參考文獻

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（責編：張宏民）