高產纖維素酶菌株的篩選

周成+徐磊+肖新+謝越+汪建飛+馬忠友

摘 要：該研究從農田土壤中分離得到67株細菌，并從中選出一株高產纖維素酶菌株。將這些菌株接種到纖維素培養基上，在pH 5.5和28℃的條件下，利用剛果紅染色溶液進行染色后，測其水解透明圈與菌落的比值的大小，進行初步篩選。將這些初篩的菌株接種到培養基中進行搖床培養后，制得粗酶液，并分析羧甲基纖維素酶（CMC）活力測定和濾紙酶（FP）活力及β-葡萄糖苷酶（BG）。在不同溫度的條件下，對纖維素酶活力測定，最終篩選出曲霉A25（Aspergillus sp.）這一株菌株，最適酶活溫度為50℃。產纖維素酶酶活力分別為：CMC酶活達2 340.92 U/mL；FP酶活達2.66U/mL；BG酶活達164.72U/mL。

關鍵詞：羧甲基纖維素酶；濾紙酶；β-葡萄糖苷酶；曲霉A25

中圖分類號 S154 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）08-22-04

Abstract：67 strains of soil bacteria were isolated form farmland，from which a high-yielding cellulase strain was screened.These strains were inoculated on the cellulose medium，and a preliminary screening was conducted，in which we measured hydrolysis transparent circle and the ratio of the size of the colony under pH5.5 and 28℃ conditions by using the Congo Red staining.Furthermore，these selected strains were cultured，and a crude enzyme liquid was extracted for analyzing the activities of carboxymethyl cellulose（CMC），filter paper enzyme（FP）and β-glucosidase（BG）.Under different temperature conditions，the activity of cellulase was determined，and ultimately this one strain of Aspergillus A25 was obtained.Its great activity is under the condition of optimum temperature for 50 ℃.Producing cellulose enzyme activity was as following：CMC amounted to 2 340.92 U/mL，FP activity amounted to 2.66 U/mL，and BG activity amounted to 164.72 U/mL.

Key words：Cerboxymethl cellulose；Filter paper enzyme；β- glucosidase；Aspergillus A25

纖維素物質是地球上含量最豐富的碳水化合物[1]，而目前人類對纖維素的開發與利用還非常有限，因此如何更有效地開發和利用纖維素資源已成為當今世界的熱門課題之一。目前，對纖維素的降解利用主要是用酸堿處理等化學手段，以及汽爆及蒸汽加熱等物理手段[2]。生物法由于對設備要求低，分解后的產物易回收利用，以及對環境污染較小等特點而備受重視。纖維素是一個復雜酶系，根據其功能的不同可分為3類：作用于纖維素非結晶區的內切葡聚糖酶（CMC）；作用于無定型區切割糖苷鍵的外切葡聚糖酶（FP）；以及作用于纖維二糖的β-葡萄糖苷酶（BG）[3-5]。協同作用才能將結構復雜的天然纖維降解。纖維素酶在食品、洗滌、紡織、飼料、造紙等方面具有廣泛的應用和發展前景[5]。通過對本實驗室保存的67株菌株進行初篩和復篩，A25這一株菌株是本次實驗所篩選的，具有較高降解纖維素活力的菌株，本文對其纖維素酶的生產培養特性進行研究，對于了解其降解機制以及實際應用都有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 從農田土壤中分離得到67株土壤細菌。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNS法標準曲線的制備 稱0.05g經105℃烘干至恒重的葡萄糖溶于少量蒸餾水中，用蒸餾水定溶至500mL配制成濃度為50μg/mL的葡萄糖溶液。取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL葡萄糖溶液再加入蒸餾水將體積配制至10mL。再分別從中取2mL，再加蒸餾水1.0mL再加DNS試劑2.0mL搖勻，置于沸水中煮沸5min，取出置與冷水中冷卻到室溫，測其OD530值。根據OD值，以葡萄糖濃度為縱坐標，吸光值為橫坐標，列出直線回歸方程（Y=aX+b）。

1.2.2 產纖維素酶菌株的培養 在無菌條件下，將67株菌株接種到纖維素培養基中，放在培養箱里溫度為28℃，培養48h。

1.2.3 剛果紅染色 把培養好的霉菌用剛果紅染色劑覆蓋培養皿一層進行染色30min。然后用0.9%生理鹽水沖洗2～3次，觀察其透明圈的大小，并計算出H/C的比值即酶活，（酶活性=透明圈直徑的值與菌落直徑的比值）。根據比值的大小進行初步篩選。

1.2.4 粗纖維酶液的制備 在無菌操作下，將初步篩選的7株霉菌分別接種到液體發酵培養基中，搖瓶培養3～4d，溫度為28℃，轉速為160r。

1.2.5 纖維素酶發酵液的處理 纖維素酶霉菌搖瓶培養好后，用循環水式抽濾機進行抽濾。將濾液轉入到原三角燒瓶中，放入冰箱備用。

1.2.6 酶活力的測定 采用DNS法（3，5-二硝基水楊酸比色法）[6-7]。

1.2.7 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）酶活力測定 以2.0mL 20%（w/v）羧甲基纖維素鈉溶液為底物，用pH5.0檸檬酸緩沖液配制）。加1mL稀釋酶液于50℃，恒溫水浴反應30min，然后加入2mL DNS顯色液，終止反應，煮沸5min，再放入冰水中冷卻至室溫。用722S分光光度計在530nm處測定光密度OD值，同時相同條件作空白樣調零。

1.2.8 濾紙（FP）酶活力測定 精確吸取4.0mL稀釋酶液和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液，置于試管中，加入新華5號濾紙條（1×3cm）一條，滴入甲苯2～3滴防腐。40℃反應24h。吸取上述濾紙酶液2.0mL加入蒸餾水1.0mL，2.0mL DNS顯色液，終止反應。沸水煮沸5min，然后再放入冷水中冷卻至室溫。在530nm處測定光密度OD值，同時相同條件下作空白調零。

1.2.9 β-葡萄糖酶（BG）活法測定 取1.0mL稀釋酶液加2.0mL pH4.6乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的1%的水楊酸溶液，50℃酶解30min，加入2.0mL DNS顯色液，終止反應，于沸水中水浴5min，用冷水冷卻至室溫，在530nm處測定其OD值，同時相同條件下作空白調零。

1.4 濾紙崩潰實驗 取稀釋酶液4.0mL和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液置于試管中。（15×50cm）加入新華5號濾紙條（1×3cm）一條，滴入甲苯2～3滴（防腐），于恒溫箱內40℃保溫24h。觀察濾紙崩潰情況，觀測標準如下：+++表示濾紙完全沉在底部，搖動試管后濾紙呈糊狀；++表示濾紙完全下沉，搖后呈小片狀；+表示濾紙沿底部呈毛狀，搖后部分溶化；-表示濾紙直立完整無缺，搖后不溶化。

1.5 還原糖含量的測定 采用DNS法[9]測還原糖。

2 結果與分析

2.1 高產纖維素酶菌株的初篩 將67株菌株接種到羧甲基固體培養基中進行培養48h，用剛果紅染色靜止30min后測其H/C的比值，結果見表2。

從本實驗室保存的67株菌株中，將各菌株分別采用纖維素固體培養基進行富集培養并進行篩選，從中篩選出高產纖維素酶菌株。從表2這些菌株的透明圈的直徑與菌落的直徑比值大小可以看出，A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD的H/C比值較高，這7株產纖維素酶能力較強，紅色水解透明圈較明顯、較大，具有較高的纖維素酶活力。H/C是透明圈與菌落的比值，比值越大酶活越強。根據紅色水解透明圈出現的快慢、大小可大致得出該菌株的產纖維素酶情況，這可作為初次判斷的依據。通過表2的結果說明A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD7株菌株具有較高的酶活力。

2.2 葡萄糖標準曲線的繪制 參照1.2.1所描述的方法制備出標準葡萄糖曲線（圖1），根據標準葡萄糖曲線求出直線回歸方程y=0.003 4x-0.505，R2=0.996 8（y：葡萄糖濃度，x：OD530的值），通過直線回歸方程可以計算纖維素酶酶促反應中產生葡萄糖的濃度，從而根據酶活力單位定義算出酶活。

2.3 高產纖維素酶菌株的復篩 挑選上述試驗中濾紙酶活性較高的7個菌株進行進一步試驗，將所獲得的菌株A25、A5、O7、0809、D2、H7、HD菌株接到液體發酵培養基中進行搖床發酵培養后，在獲得發酵液的基礎上制得粗酶液。測定其濾紙酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活。各菌株均設3個處理，取其平均值，如表3。

2.4 溫度對酶促反應的影響 溫度對酶促反影響的原因主要有以下2個方面，一是溫度對酶蛋白穩定性的影響，即對酶熱變性失活作用，二是溫度對酶促反應本身的影響，其中可能包括影響酶和底物的結合，影響Vmax，影響酶和底物分子解離基團的pK，影響酶與抑制劑、激活劑或輔酶的結合等[8]。吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸餾水加入試管分別于40℃、50℃、60℃、70℃和80℃不同水浴鍋中處理30min后，對菌體的酶活進行檢測，其結果見圖2。由圖2可見，反應溫度對菌株A25的酶活有顯著影響，其最適酶活溫度為50℃，當水浴處理溫度高于50℃或低于50℃時，該菌株A25酶活減弱，但是培養液仍具有較高的纖維素酶活力；同時也表明該菌株所產的纖維素酶具有較高熱穩定性。可見，50℃所測得的酶活力最高，即此酶的最適酶活溫度為50℃。

3 討論

3.1 高產纖維素酶菌株的初篩 纖維素在纖維素酶的作用下水解成纖維二糖和葡萄糖，水解后的糖類與剛果紅染料形成紅色沉淀，使產酶菌株的菌落周圍出現清晰的紅色水解圈，根據水解圈的大小可粗略的估計菌株產酶的情況，然后選取透明圈較大的菌株進行接種。剛果紅是對纖維素酶進行初步篩選的試驗方法，實驗方法比較簡單。通過它可以使纖維素固體培養基上的菌種的代謝產物形成淺紅色水解透明圈。用剛果紅染液覆蓋培養皿一層靜止染色30min，纖維素酶菌株產纖維素酶越多，產生的紅色水解透明圈越大，產纖維素酶速度越快，淺紅色水解透明圈出現的越早。雖然水解透明圈H/C的比值大小直接反映了酶活水平的高低，但不能完全代表菌株產酶能力，不能定量說明該菌株產纖維素酶的能力。也有研究表明液體樣品的酶濃度與透明圈的直徑（下轉127頁）（上接24頁）成線性關系，可以對酶活進行初步定量[10]。

3.2 高產纖維素酶菌株的復篩 已知纖維素酶的作用方式：CO酶是使天然纖維素晶體分鏈，起一個分離和水合作用，從而使天然纖維素裂解成為直鏈纖維素；而C0酶雖不能水解天然纖維素，但能水解直鏈纖維素的β-l，4-葡萄糖苷鍵生成纖維二糖，纖維二糖再經β-葡萄糖苷酶水解成為葡萄糖。前人研究認為，纖維素的降解關鍵是濾紙酶活的高低，再結合β-葡萄糖苷酶活，而CMC酶活只作參考。通過對7個菌株發酵液的濾紙酶活、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶活進行測定，初步篩選出產纖維素酶活力較高的A25菌株。初步試驗表明，在50℃反應時間30min，pH5.5時A25菌株產生的纖維素酶的活性有較大提高。建議對A25進行進一步的優化試驗，以探明其最適的產酶條件，或對其進行進一步的誘變，以提高其酶活性應用于生產實踐。

3.3 溫度對纖維素酶活性的影響 從粗酶液中吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸餾水加入試管中，在不同的水浴溫度下水浴處理30min后，對菌體的產酶量進行檢測。為了確定酶活的最適溫度，通過測40～80℃不同溫度下的實驗確定酶活，不同培養溫度對纖維素酶有不同的影響，結果表明，曲霉A25水浴處理在40℃時酶活力表現較低，50℃時酶活力達到最大值，水浴處理溫度超出50℃時酶活力逐漸變小。對于纖維素酶活的最適溫度為50℃，即纖維素酶產量的最適溫度在50℃。

參考文獻

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（責編：張宏民）