旋覆代赭湯及其拆方對RE大鼠血漿Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響*

苗嘉萌，楊幼新，馬　艷，許云姣，鄧艷蓉，戚經(jīng)天，袁紅霞

（天津中醫(yī)藥大學，天津　300193）

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旋覆代赭湯及其拆方對RE大鼠血漿Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響*

苗嘉萌，楊幼新，馬艷，許云姣，鄧艷蓉，戚經(jīng)天，袁紅霞

（天津中醫(yī)藥大學，天津300193）

摘要：[目的]探討反流性食管炎（RE）食管黏膜血漿細胞能量代謝與黏膜損傷的關系以及旋覆代赭湯治療RE的作用機制。[方法]將120只Wistar大鼠按照隨機數(shù)字法隨機分為10組，每組12只，即正常組、模型組、旋覆代赭湯全方組（全方組）、苦降組、甘升組、升降相因組、去苦降組、去甘升組、去升降相因組和西藥組；除正常組外，其余9組行“4.2 mm幽門夾+胃底2/3結扎術”造模。治療14 d后，即造模后第22天處死，檢測各組大鼠血漿Na+-K+-ATP酶及Ca(2+)-Mg(2+)-ATP酶的活性。[結果]實驗后各模型組大鼠ATP酶活性低于正常組；全方組、西藥組酶活性較好，與正常組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與模型組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；苦降組及去甘升組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與全方組及西藥組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；正常組與其他各組比較，均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；西藥組與全方組比較，差異無統(tǒng)計學意義。[結論]旋覆代赭湯全方組能提高模型大鼠血漿Na+-K+-ATP酶及Ca(2+)-Mg(2+)-ATP酶的活性，改善模型大鼠食管黏膜組織形態(tài)學病變，且作用優(yōu)于各拆方組。

關鍵詞：反流性食管炎；旋覆代赭湯；氣機升降；血漿Na+-K+-ATP酶及Ca(2+)-Mg(2+)-ATP酶

反流性食管炎（RE）是指胃、十二指腸內(nèi)容物反流入食管而引起食管黏膜損傷的一種慢性難治性疾病[1]。現(xiàn)代醫(yī)學主要以抑酸、促胃腸動力等藥物治療RE，但并不能從根本上解決反流問題，且具有復發(fā)率高、不良反應大、醫(yī)療費高等弊端[2-3]。因此，尋找治療RE有效、合理的方案，一直是醫(yī)學界探索的熱點和難點。課題組多年來運用氣機升降理論[4]，謹守胃虛氣逆這一病機，應用經(jīng)典名方旋覆代赭湯治療RE[5]，取得了良好的臨床療效[6-7]。為了探求其作用機制，本實驗比較了旋覆代赭湯及其拆方對大鼠血漿Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶酶活性的差異。

1　實驗材料及方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康雄性Wistar大鼠120只，體質(zhì)量（200±20）g，由軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所提供，合格證書編號：MA-2014-111，飼養(yǎng)于Ⅱ級動物飼養(yǎng)室。

1.1.2實驗藥物1）全方組：旋覆花15g，代赭石5g，清半夏10 g，生姜25 g，人參10 g，炙甘草15 g，大棗15 g。2）拆方組各組：苦降組由旋覆花15 g，代赭石5 g組成；甘升組由人參10 g，炙甘草15 g，大棗15 g組成；升降相因組由清半夏10 g，生姜25 g組成；全方去苦降組由清半夏10 g，生姜25 g，人參10 g，炙甘草15 g，大棗15 g組成；全方去甘升組由旋覆花15 g，代赭石5 g，清半夏10 g，生姜25 g組成；全方去升降相因組由旋覆花15 g，代赭石5 g，人參10 g，炙甘草15 g，大棗15 g組成。3）中藥全部選用顆粒劑，由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供，將按照規(guī)定劑量的中藥顆粒劑倒入容器內(nèi)，加熱水（水溫為80～100℃）充分攪拌，調(diào)制成9.6 g/mL溶液。4）西藥組用藥為枸櫞酸莫沙比利片（魯南貝特制藥有限公司）與蘭索拉唑腸溶片（汕頭市經(jīng)濟特區(qū)鉈濱制藥廠），按照藥品說明書用量，研成極細粉末，配制成濃度為0.15 g/L的混懸液后裝瓶。5）上述藥物均置4℃冰箱備用。

1.1.3實驗試劑病理包埋、染色等所需基本試劑由天津市中西醫(yī)結合急腹癥研究所提供；生理鹽水、0.5%碘伏、注射用左氧氟沙星由揚子江藥業(yè)集團有限公司提供；10%水合氯醛、10%甲醛溶液，蘇木精-伊紅染色液由天津市化工二廠提供；考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒，超微量ATP酶測試盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.4實驗器材手術剪、尖頭組織鑷、動脈夾、3/0帶針縫線、6/0帶針縫合線、持針器、注射器等常規(guī)手術器械（上海醫(yī)療器械廠）；直徑4.2 mm圓柱形鋼條、直徑3.0 mm的雙扁鐵心包扎線（夾心金屬直徑0.3 mm）；NOVEL光學顯微鏡，型號為XS2-106B （N）；日立透射電子顯微鏡，型號H7650（中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所提供）；萊卡超薄切片機，型號EMUC6；防脫氨基載玻片；精密電子天平，型號AE16O型；Heraeus臺式高速離心機，型號PLCO型；低溫離心機，型號5810R型；722光柵分光光度計，型號96306J031；恒溫水浴箱，型號DZW-4型。

1.2方法

1.2.1分組將120只Wistar大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d，按照隨機數(shù)字法隨機分為10組，每組12只，即正常組、模型組、旋覆代赭湯全方組及拆方各組、西藥組，共計10組，每組12只。

1.2.2造模手術嚴格按照無菌操作要求，造模組大鼠于術前24 h禁食不禁水，采用“4.2 mm幽門夾+胃底2/3結扎術”法造模[8]；正常對照組行假手術。各組術后24 h禁食不禁水，術后3 d，每日腹腔內(nèi)注入鹽酸左氧氟沙星注射液1.5 mg/kg，預防感染。此后常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2.3藥物干預正常組：于造模7 d后，予生理鹽水按10 mL/kg體質(zhì)量灌胃，每日2次，與治療組同日處死。模型組：同正常組。各治療組：即旋覆代赭湯全方組、拆方各組及西藥組，共計8組，于造模術后7 d開始，予相應藥液按照10 mL/kg體質(zhì)量灌胃，每日2次，經(jīng)治療14 d后，即造模后第22天處死各組動物進行指標檢測。

1.2.4處死及取材各組動物處死前24 h，禁食不禁水，麻醉后，迅速開腹，胃—食管交界上0.5 cm處向咽喉部截取1.5～2.0 cm長的食管組織，用冰生理鹽水清洗，然后將取下的食管組織，浸泡于10%福爾馬林中，常規(guī)制備病理切片。同時迅速從腹主動脈取血2 mL，置于含有10%EDTA二鈉60 μL的離心管中混勻，4℃離心（3 000 r/min，15 min），取血漿后分裝，放入-70℃冰箱保存?zhèn)錂z。

2　指標觀察與檢測

2.1指標觀察記錄每日大鼠的死亡數(shù)、死亡率、死亡原因、皮毛、飲水變化量、精神狀態(tài)及活動情況、體質(zhì)量等[9]。

2.2指標檢測

2.2.1食管黏膜組織肉眼及病理形態(tài)學觀察肉眼觀察食管上皮組織并進行RE分級，將病理切片行HE染色并通過光鏡觀察，對其進行RE病理分級[10]。

2.2.2血漿Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的檢測測定原理：ATP酶可分解成ADP及無機磷，測定無機磷的量可判斷ATP酶活力的高低。規(guī)定每小時1 mg血漿組織蛋白的ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmoL無機磷的量為1個ATP酶活力單位。具體測定過程、計算方法及注意事項嚴格按照測試盒說明說執(zhí)行。

2.3統(tǒng)計學方法使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LDS法，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunne’t T3；P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

3　實驗結果

3.1一般情況造模術后22 d，大鼠共死亡19只，各組具體死亡情況（詳見表1）。實驗前各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義，實驗后各模型組大鼠體質(zhì)量明顯低于實驗前，與正常對照組比較也明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；灌胃后14 d后，全方組、西藥組恢復最好，與模型組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；苦降組及去甘升組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與全方組及西藥組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；正常組與其他各組比較，均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；西藥組與全方組比較，差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

表1　造模后22 d各組大鼠死亡情況及原因分析Tab.1 Analysis of rats death condition and reason after molding 22 days of each group只

3.2食管黏膜肉眼觀察表現(xiàn)積分及鏡下病理改變模型組與正常組比較肉眼表現(xiàn)積分及鏡下病理積分差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；全方組、西藥組較模型組肉眼積分和病理積分差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），甘升組、升降相因組二組之間肉眼積分無統(tǒng)計學差異，但與其他各組比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），而甘升組、升降相因組兩組之間病理積分無統(tǒng)計學差異，但與其他各組比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；苦降組與全方組相較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見表3、表4）。

表2　治療前后各組大鼠體質(zhì)量變化情況統(tǒng)計（±s）Tab.2 The rats body weight change statistics of rats before and after treatment of each group（±s）

組別　實驗前體質(zhì)量（g）實驗后體質(zhì)量（g）體質(zhì)量變化（g）正常組　219.8±8.4　 246.6±14.2　 26.8±4.4模型組　219.9±8.7　 163.0±8.5　 -56.8±4.6西藥組　218.4±9.2　 205.8±10.1　 -12.7±5.7全方組　219.2±10.5　 209.6±6.4　 -9.7±4.5甘升組　220.1±9.2　 184.5±8.9　 -35.6±5.6苦降組　219.3±8.0　 163.8±10.5　 -55.4±6.3升降相因組　218.3±7.6　 183.4±8.7　 -34.8±5.1去甘升組　219.2±1.6　 164.8±9.5　 -55.4±7.9去苦降組　220.1±10.1　 184.4±8.6　 -35.7±1.5去升降相因組　218.3±8.9　 182.4±8.9　 -35.9±0

表3　各組大鼠食管黏膜肉眼分級及積分（±s）Tab.3 The esophageal mucosa naked eye grading and integral in rats of each group（±s）

組別　　動物數(shù)　　肉眼分級（只）　　積分（分）0級Ⅰa級Ⅰb級Ⅱ級Ⅲ級正常組　10　 9　 1　 0　 0　 0　 0.10±0.30模型組　7　 0　 0　 1　 4　 2　 2.21±0.57西藥組　9　 4　 2　 2　 1　 0　 0.78±0.79全方組　9　 4　 2　 3　 0　 0　 0.72±0.71甘升組　8　 0　 3　 5　 0　 0　 1.31±0.26苦降組　7　 0　 2　 4　 1　 0　 1.53±0.35升降相因組　8　 0　 1　 5　 2　 0　 1.33±0.32去苦降組　8　 1　 2　 4　 1　 0　 1.25±0.59去甘升組　7　 0　 1　 0　 5　 1　 2.00±0.58去升降相因組　8　 0　 2　 5　 1　 0　 1.58±0.32

3.3血漿Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的測定實驗后各模型組大鼠酶活性低于正常對照組；灌胃后14 d后，全方組、西藥組酶活性最好，與正常組差異不明顯，與模型組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；苦降組及去甘升組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與全方組及西藥組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；正常組與其他各組比較，均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；西藥組與全方組比較，差異無統(tǒng)計學意義，見表5。

表4　各組大鼠食管黏膜病理分級及積分（±s）Tab.4 The esophageal mucosa pathological grading and integral of rats in each group（±s）

表4　各組大鼠食管黏膜病理分級及積分（±s）Tab.4 The esophageal mucosa pathological grading and integral of rats in each group（±s）

組別　　動物數(shù)　　病理分級（只）　　積分（分）正常　輕度　中度　重度正常組　10　 10　 0　 0　 0　 0.00±0.00模型組　7　 0　 0　 1　 6　 2.86±0.38西藥組　9　 5　 4　 0　 0　 0.67±0.50全方組　9　 4　 5　 0　 0　 0.56±0.53甘升組　8　 1　 2　 5　 0　 1.50±0.76苦降組　7　 0　 0　 2　 5　 2.71±0.49升降相因組　8　 1　 0　 7　 0　 1.65±0.71去苦降組　8　 2　 1　 5　 0　 1.38±0.92去甘升組　7　 0　 2　 5　 0　 2.57±0.53去升降相因組　8　 1　 1　 6　 0　 1.63±0.74

表5　實驗后各組大鼠血漿Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性表（±s）Tab.5 Table of plasma Na+-K+-ATP and Ca2+-Mg2+-ATP enzymes of rats after the experiment in each group（±s）

表5　實驗后各組大鼠血漿Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性表（±s）Tab.5 Table of plasma Na+-K+-ATP and Ca2+-Mg2+-ATP enzymes of rats after the experiment in each group（±s）

Ca2+-Mg2+-ATP酶活性[μmol/（mg·h）]正常組　10　0.625±1.112　0.712±0.967模型組　7　0.247±0.747　0.341±0.944西藥組　9　0.550±1.09　0.652±1.112全方組　9　0.534±0.981　0.621±1.098甘升組　8　0.519±1.64　0.628±1.342苦降組　7　0.254±0.094　0.356±1.094升降相因組　8　0.504±1.76　0.612±1.661去苦降組　8　0.328±1.32　0.423±1.321去甘升組　7　0.330±0.770　0.420±1.170去升降相因組　8　0.354±1.67　0.414±1.067組別　　動物數(shù)Na+-K+-ATP酶活性[μmol/（mg·h）]

4　討論

現(xiàn)代醫(yī)學認為，食管下括約肌（LES）壓力降低及一過性松弛為RE發(fā)病的主要機制之一。LES壓力主要來源于平滑肌的舒縮功能，ATP酶是哺乳動物能量轉(zhuǎn)換及代謝的主要介質(zhì)。ATP酶是能量產(chǎn)生的催化劑，能量代謝異常可影響肌肉的正常收縮功能[11-12]。Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶不僅為細胞維持正常形態(tài)和功能提供了條件，而且建立了一種勢能貯備，為平滑肌收縮提供了動力。本實驗通過手術的方法制備酸堿混合反流型RE大鼠模型，運用拆方法研究觀察旋覆代赭湯及其拆方對于RE模型大鼠一般情況、食管病理形態(tài)、血漿Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響，從而討論脾胃氣機升降和線粒體能量代謝之間的密切聯(lián)系，從能量代謝的角度闡釋RE的發(fā)病機制。血漿細胞中Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯降低時，細胞外Na+、Ca2+進入膜內(nèi)，兩者競爭性抑制，由于滲透壓的關系，水分子進入胞膜內(nèi)，引起細胞腫脹，破壞細胞結構，最終導致血液循環(huán)不暢，這可能是引起或加重食管黏膜組織水腫主要原因。

通過對比各相關指標，發(fā)現(xiàn)全方組優(yōu)于其他拆方組，其中苦降組大鼠生活質(zhì)量、病理程度、酶活性最差，與模型組相比無差異。由此可以推斷，旋覆代赭湯全方能夠明顯提高RE大鼠血漿Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，從而確保食管上皮細胞營養(yǎng)物質(zhì)的吸收前提條件，從而保證食管黏膜細胞完整性，或修復已受損的食管黏膜細胞。而苦降組驗證了課題組對于RE主要病機的論述，即胃虛氣逆。苦降組用藥寒涼，苦寒傷正，只降不升，本虛亦甚，氣機壅滯，故不能起到治療之功。綜上所述，旋覆代赭湯全方具有益氣健脾，降逆化痰的功效，可調(diào)節(jié)脾胃氣機，扶中降逆，攻補兼施，標本同治，從而達到治療RE的目的。本研究從科學角度探討了線粒體能量代謝與旋覆代赭湯作用機制的相關性，不但進一步驗證了RE的關鍵病機是“胃虛氣逆”，從而為旋覆代赭湯是否通過調(diào)節(jié)脾胃氣機升降，從而調(diào)節(jié)線粒體能量代謝，改善LES舒縮功能，來治療RE提供了有力依據(jù)。

參考文獻：

[1]王慶治，張幫杰，王素娟.反流性食管炎臨床流行病學分析[J]. 2011，30（13）：125-126.

[2] Pellegrini CA. Gastro -oesophageal reflux disease [J].Lancet，2005，367（14）：241-246.

[3]陳灝珠.實用內(nèi)科學[M].第12版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：1849-1850.

[4]劉菊，葉秋榮，于盼盼，等.胃食管反流病中醫(yī)證型演變規(guī)律研究[J].山西中醫(yī)，2014，30（5）：45-47.

[5]袁紅霞，張鵬，田晶晶.旋覆代赭湯治療反流性食管炎研究思路[A].中華中醫(yī)藥學會脾胃病分會.中華中醫(yī)藥學會脾胃病分會第二十五屆全國脾胃病學術交流會論文匯編[C].中華中醫(yī)藥學會脾胃病分會，2013：2.

[6]中華醫(yī)學會消化內(nèi)鏡學分會.RE診斷及治療指南（2003年）[J].中華消內(nèi)鏡雜志，2004，21（4）：221-222.

[7]唐麗明，張鵬，賈瑞明，等.旋覆代赭湯對RE模型大鼠食管粘膜Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2013，9（20）：220-224.

[8]鄒方明.慢性反流性食管炎大鼠模型的建立及5-羥色胺4受體激動劑的抗食管黏膜炎癥作用[D].福州：福建醫(yī)科大學：2012.

[9]楊幼新，袁紅霞，魏愛勤，等.旋覆代赭湯對反流性食管炎模型大鼠食管粘膜組織形態(tài)影響的實驗研究[J].天津中醫(yī)藥，2008，25（6）：484-486.

[10]中華醫(yī)學會消化內(nèi)鏡分會.反流性食管炎診斷及治療指南[S].中華消化內(nèi)鏡雜志，2004，21（4）：221-222.

[11]彭成，曹小玉，周智科，等.四君子顆粒對脾虛動物胃腸細胞保護作用的機理研究[J].成都中醫(yī)藥大學學報，2001，24（1）：32-34.

[12]曾益宏.脾虛證與線粒體基因多態(tài)性及胃泌素和ATP酶的相關性研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2007：48.

（本文編輯：馬英，于春泉）

Effects of Xuanfu Daizhe decoction on Na+-K+-ATP and Ca2+-Mg2+-ATP enzymes activity of plasma in reflux esophagitis rats

MIAO Jia-meng，YANG You-xin，MA Yan，XU Yun-jiao，DENG Yan-rong，QI Jing-tian，YUAN Hong-xia，
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

Abstract:[Objective] Expolration on the esophageal mucosa cell energy metabolism dysfunction and mucosal damage and function mechanism of Inula Daizhe decoction in treating reflux esophagitis（RE）. [Methods] The 120 Wistar rats were randomly divided into 10 groups，with 12 rats in each group and normal control group，model control group，Inula Daizhe decoction group Quanfang group，Kujiang group，Gansheng group，Shengjiang Xiangyin group，Quanfang subtraction Kujiang group，Quanfang subtraction Gansheng group，Quanfang subtraction Shengjiang Xiangyin group and Western medicine group；in addition to the normal control group（normal group），the other 9 groups molding by“4.2 mm pylorus clamp+gastric bottom two-thirds ligation”，after treatment of 14 days，the rats were sacrificed，and the activity of Na+-K+-ATP and Ca(2+)-Mg(2+)-ATP in plasma was detected. [Results] After the experiment ATP enzyme activity in the model group rats lower than normal control group；enzymes activity in Quanfang group and Western medicine group was best，compared with normal group，and the difference was not obvious，compared with model group the difference was significant（P＜0.05）；compared with Kujiang group and Quanfang subtraction Gansheng group with model group，the difference was not statistically significant（P＞0.05）. Compared with Quanfang group and Western medicine group，it was statistical significance（P＜0.05）. Compared the normal group with the other groups，the differences were statistically significant（P＜0.05）；compared Western medicine group with Quanfang group，the difference was no statistically significant. [Conclusion] Xuanfu Daizhe decoction Quanfang group can improve plasma Na+-K+-ATPase and Ca(2+)-Mg(2+)-ATPase activity in the model rat，improve the model of rat esophageal mucosa tissue morphologic changes and the effect is better than that of the demolition party group.

Key words:reflux esophagitis；Xuanfu Daizhe decoction；ascending and descending of Qi；Na+-K+-ATPase and Ca(2+)-Mg(2+)-ATPase

收稿日期：（2015-12-25）

作者簡介：苗嘉萌（1990-），男，碩士，研究方向為全科醫(yī)學。通訊作者：楊幼新，E-mail：youxin _ yang@hotmail.com。

*基金項目：國家自然科學基金項目（81173243）。

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2016.04.11

中圖分類號：R256.31

文獻標志碼：A

文章編號：1672-1519（2016）04-0231-04