MTBDRplus V2用于診斷涂陰疑似肺結核患者的效果評價

李強 包訓迪 劉元 趙冰 歐喜超 趙雁林

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MTBDRplus V2用于診斷涂陰疑似肺結核患者的效果評價

李強 包訓迪 劉元 趙冰 歐喜超 趙雁林

目的 評價MTBDRplus V2線性探針技術(簡稱“MTBDRplus V2”)用于診斷涂陰疑似肺結核患者的檢測效能。 方法 連續納入2014年1—12月在安徽省胸科醫院和西安市胸科醫院就診的涂陰疑似肺結核患者1973例，對其1973份痰標本同時開展MTBDRplus V2和MGIT 960快速液體培養(mycobacterial detection system，BACTECTMMGITTM960，簡稱“MGIT 960培養法”)，對培養陽性鑒定為結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)的菌株，開展利福平和異煙肼藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，對兩種方法耐藥檢測結果不一致樣本進行耐藥相關基因測序驗證。采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，兩種方法對MTBC檢出率的比較使用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。對利福平和異煙肼耐藥基因檢測的效能比較分析用敏感度、特異度進行效果評估。 結果 1973例涂陰疑似肺結核患者中，MTBDRplus V2和MGIT 960培養法對MTBC的檢出率分別為27.67%(546/1973)和26.76%(528/1973)，差異無統計學意義(χ2=0.05，P=0.974)。以MGIT 960培養法為標準，MTBDRplus V2檢測痰標本中MTBC的敏感度和特異度分別為86.74%(458/528)和93.84%(1356/1445)。以MGIT 960藥敏試驗檢測利福平和異煙肼耐藥結果為標準，MTBDRplus V2檢測利福平和異煙肼耐藥性的敏感度分別為94.34%(50/53)和77.38%(65/84)，特異度為96.62%(372/385)和98.02%(347/354)。結論 MTBDRplus V2可快速準確檢測出涂陰疑似肺結核患者痰標本中的MTBC，并可同時檢測利福平和異煙肼對MTBC的藥物敏感性，其檢測結果敏感度和特異度高，對于結核病防控有很好的應用價值。

結核, 肺； 分子探針技術； 分枝桿菌, 結核； 痰； 藥物敏感性試驗； 評價研究

結核病是嚴重危害公眾健康的全球性公共衛生問題，每年數百萬例感染患者，死亡患者在感染性疾病中居第二位[1]。中國是全球第三大結核病高負擔國家，結核病發病患者始終居傳染病前列[1]。2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查結果顯示，人群中活動性肺結核患病率沒有明顯下降，但涂陽患者比例大幅度下降[2]。由于缺乏有效的診斷涂陰結核病的病原學檢測方法，使涂陰結核病特別是耐藥結核病患者不能得到及時有效的診斷和治療。

MTBDRplus V1(Hain Lifescience,德國)是一種可以通過反向探針雜交技術快速檢測樣本中結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)，以及利福平和異煙肼耐藥性的分子技術，報告時間短(6～8 h)，近幾年在全球范圍已廣泛應用[3-6]，2008年被WHO推薦用于涂陽肺結核患者的耐藥診斷[7]。與MTBDRplus V1相比，MTBDRplus V2(Hain Lifescience,德國)極大提高了檢測樣本中MTBC的敏感度，可直接對涂陰肺結核患者的痰標本進行病原學檢測[8]。然而，目前國內尚沒有關于MTBDRplus V2用于臨床診斷的研究報道。本研究以涂陰疑似肺結核患者為研究對象，評價該技術用于診斷涂陰疑似肺結核患者的應用價值，為涂陰疑似肺結核患者的診斷提供科學依據。

材料和方法

一、患者來源

連續納入2014年1—12月在安徽省胸科醫院和西安市胸科醫院就診的胸部X線表現不典型、咳嗽咯痰>2周、有或無肺結核臨床癥狀的連續3次痰涂片鏡檢抗酸桿菌陰性(簡稱“涂陰”)的疑似肺結核患者1973例(研究中使用臨床剩余痰)，其中安徽省胸科醫院966例(份)，西安市胸科醫院1007例(份)。

二、實驗室檢測

1.痰標本處理：痰標本采用中和離心法去污染處理，按照實驗室標準化流程[9]，采用N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH (NALC-NaOH)消化液處理，消化后的菌液沉淀重懸于2 ml的磷酸鹽緩沖液中，分裝兩份分別進行BACTEC MGIT 960快速液體培養(mycobacterial detection system，BACTECTMMGITTM960，簡稱“MGIT 960培養法”)和MTBDRplus V2線性探針技術(簡稱“MTBDRplus V2”)檢測。

2. MGIT 960培養法和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)：加入0.5 ml處理后的痰標本至MGIT 960培養管(含0.8 ml OADC營養添加劑)中，對培養陽性鑒定為MTBC的菌株，嚴格按照操作手冊將其加入含有利福平(1 μg/ml)和異煙肼(0.1 μg/ml)藥物的培養管中，開展利福平和異煙肼的耐藥檢測。

3.MTBDRplus V2 檢測：實驗在4個獨立房間進行，包括試劑準備間、模版制備區、擴增區和雜交區。實驗操作嚴格按照MTBDRplus V2操作說明，取0.5 ml處理后的痰標本13 000×g離心5 min，棄上清，沉淀用100 μl分子級雙蒸水懸浮，95 ℃水浴20 min提取核酸DNA備用；每個樣本取5 μl核酸DNA加入含有35 μl AM-B和10 μl AM-A試劑的擴增體系中(Hain, MTBDRplus V2試劑盒)，PCR擴增40個循環；取20 μl擴增產物經過化學變性、雜交孵育、洗滌、耦聯和顯色后，根據試紙條上的探針顯色結果判定樣本中是否含有MTBC及其對利福平和異煙肼的耐藥性。

4.測序：對兩種方法耐藥檢測結果不一致的樣本進行耐藥相關基因測序驗證。采用16SrRNA基因測序進行結核分枝桿菌菌種鑒定，rpoB基因測序用于利福平耐藥基因檢測，katG和inhA用于異煙肼耐藥基因檢測。擴增產物由天一輝遠生物技術有限公司進行單向測序，序列提交至美國國立生物技術信息中心(NCBI)網站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)做同源性比較或多序列比對，引物序列見表1。

三、統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，對MTBC檢出率的比較使用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。MGIT 960培養法和MTBDRplus V2對MTBC、利福平和異煙肼耐藥基因檢測效能的比較分析用敏感度、特異度進行效果評估。

結 果

一、兩種方法對MTBC檢出率的比較

MTBDRplus V2和MGIT 960培養法對MTBC檢出率分別為27.67%(546/1973)和26.76%(528/1973)，兩種方法檢出率差異無統計學意義(χ2=0.05，P=0.974)(表2)。

二、 兩種方法對MTBC 檢測效能的比較分析

以MGIT 960培養法為標準，MTBDRplus V2檢測MTBC的敏感度和特異度分別為86.74%(458/528)和93.84%(1356/1445)(表3)。

三、兩種方法對利福平耐藥基因檢測效能比較分析

以MGIT 960藥敏試驗檢測利福平耐藥結果為標準，MTBDRplus V2檢測利福平耐藥性的敏感度為94.34%(50/53)，特異度為96.62%(372/385)，不同研究現場數據差異不大(表4)。對利福平基因型和表型耐藥結果不一致的16例樣本進行rpoB基因測序，結果顯示12例樣本的測序結果與MTBDRplus V2檢測結果一致，一致率為75.00%。

表1 耐藥基因測序引物序列

表2 兩家醫院MTBDRplus V2和MGIT 960培養法對涂陰疑似肺結核患者MTBC檢出率的比較

注a：培養陽性菌株進行測序鑒定

表3 兩家醫院MTBDRplus V2對MTBC檢測的敏感度和特異度

表4 兩家醫院MTBDRplus V2進行利福平藥物敏感性檢測的敏感度和特異度

表5 兩家醫院采用MTBDRplus V2進行異煙肼藥物敏感性檢測的敏感度和特異度

四、兩種方法對異煙肼耐藥基因檢測效能比較分析

以MGIT 960培養法檢測異煙肼耐藥結果為標準，MTBDRplus V2檢測異煙肼的敏感度為77.38%(65/84)，特異度為98.02%(347/354)(表5)。對異煙肼基因型和表型耐藥結果不一致的26例樣本進行katG和inhA基因測序，結果顯示，23例樣本的測序結果與MTBDRplus V2檢測結果一致，一致率88.46%。

討 論

本研究率先通過臨床對照研究將有前景的MTBDRplus V2檢測方法用于涂陰疑似肺結核疾病的診斷中，結果表明 1973例患者中，MTBDRplus V2對MTBC檢出率為27.67%(546/1973)，與MGIT 960培養法的檢出率26.76%(548/1973)相比，差異無統計學意義(χ2=0.05，P=0.974)，但MTBDRplus V2檢測方法將報告時間從15 d縮短到了1 d[10]，與本研究一致。此外，以MGIT 960培養法為標準，MTBDRplus V2檢測MTBC的敏感度、特異度分別為86.74%(458/528)和 93.84%(1356/1445)，說明其檢測效能高。MTBDRplus V2在檢測MTBC的同時還可以檢測MTBC對利福平和異煙肼的耐藥性。與MGIT 960藥敏試驗結果相比，MTBDRplus V2檢測利福平耐藥性的敏感度達到94.34%(50/53)以上，而國內研究報道，MTBDRplus V1檢測利福平耐藥性的敏感度僅88%[10]。對利福平基因型和表型耐藥結果不一致患者樣本進行利福平耐藥相關基因(rpoB基因)耐藥決定區的測序驗證，MTBDRplus V2和測序結果一致率為75.00%(12/16)，結果與國內相關研究報道相符[11]，但低于國外文獻報道[12]，可能與不同國家流行菌株不同有關。

與MGIT 960藥敏試驗結果相比，MTBDRplus V2檢測異煙肼耐藥性的敏感度為77.38%(65/84)，造成敏感度較低的原因，可能是由于其檢測的耐藥相關基因為katG和inhA基因，這2個基因與異煙肼耐藥相關性一般為70%[13]。對異煙肼基因型和表型耐藥結果不一致的患者樣本進行異煙肼耐藥相關基因(katG和inhA基因)耐藥決定區的測序驗證，88.46%(23/26)的患者樣本的測序結果和MTBDRplus V2的檢測結果一致。有研究報道oxyR-ahpC等基因與異煙肼耐藥有一定相關性[14]。本研究中，MTBDRplus V2檢測異煙肼耐藥性的結果為“敏感”而MGIT 960培養法檢測異煙肼耐藥性的結果為“耐藥”的19例樣本中，測序結果均未發現katG和inhA存在突變。這一結果提示，MTBDRplus V2檢測異煙肼耐藥性的靶基因需要進一步完善。

綜上所述，MTBDRplus V2檢測MTBC的敏感度和特異度高、時間短，診斷涂陰疑似肺結核的可靠性強，同時可以準確檢測利福平和異煙肼的耐藥性，對指導涂陰疑似肺結核的防控具有重要意義。與其他分子檢測技術如GeneXpert MTB/RIF和環介導等溫擴增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)等技術相比，MTBDRplus V2對實驗室要求較高，需要具備有4個獨立的檢測區域，適合在地市級以上結核病診療機構的實驗室開展。

志謝 安徽省胸科醫院和西安市胸科醫院的結核科醫生對本研究做出了杰出貢獻

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(本文編輯：孟莉 范永德)

A performance evaluation of MTBDRplus V2 for tuberculosis diagnosis in smear negative pulmonary tuberculosis suspects

LIQiang,BAOXun-di,LIUYuan,ZHAOBing,OUXi-chao,ZHAOYan-lin.

NationalTuberculosisReferenceLaboratory,NationalCenterforTuberculosisControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,ChinaCorrespondingauthor:ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To evaluate the performance of MTBDRplus version 2 (MTBDRplus V2) line probe assay for diagnosis of TB in the suspects with smear negative pulmonary tuberculosis. Methods The people who were clinically suspected to have smear negative pulmonary tuberculosis (PTB) and detected in Anhui Chest Hospital and Xi’an Chest Hospital from January 2014 to December 2014 were consecutively enrolled into this study. A total of 1973 smear negative PTB suspects were enrolled and one sputum specimen was collected from each of them to conduct MTBDRplus V2 and BACTECTMMGITTM960 (MGIT 960) liquid culture, respectively. MGIT drug susceptibility testing (DST) for rifampin and isonozid was also performed once the liquid culture was positive andMycobacteriumtuberculosiscomplex (MTBC) was identified. Finally, the drug resistance related genes sequencing was performed for the samples with inconsistent results of drug resistance between MTBDRplus V2 and MGIT DST to confirm the drug resistance status. SPSS 22.0 was used for statistic analysis andχ2test was used to compare the detection rate of MTBC by using the two diagnostic methods. Statistical significance was defined asP<0.05. The sensitivity and specificity were applied to evaluate the performance of MTBDRplus V2 in the identification of MTBC and the detection of rifampincin and isonizid resistance. Results Among 1973 enrolled cases who were suspected to have smear negative PTB, the identification rate of MTBC by using MTBDRplus V2 and MGIT 960 were 27.67% (546/1973) and 26.76% (528/1973), respectively. The difference has no statistical significance (χ2=0.05，P=0.974). Compared with MGIT 960, the sensitivity and specificity of MTBDRplus V2 in the identification of MTBC was 86.74% (458/528) and 93.84% (1356/1445), respectively. Compared with MGIT DST，the sensitivity of MTBDRplus V2 in the detection of rifampicin and isonizid resistance was 94.34% (50/53) and 77.38% (65/84) respectively, and the specificity in the detection of rifampicin and isonizid resistance was 96.62% (372/385) and 98.02% (347/354), respectively. Conclusion MTBDRplus V2 is a rapid and reliable method in the diagnosis of MTBC among smear negative PTB suspects. At the same time, it also can tell us whether the patients diagnosed as having MTBC are susceptible to rifampin and isonizid or not, and both its sensitivity and specificity of drug resistance detection are high. Thus, this method has a good application value in the TB control and prevention.

Tuberculosis,pulmonary； Molecular line probe assay；Mycobacteriumtuberculosis； Sputum； Drug susceptibility testing； Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.07.006

“十二五”國家科技重大專項(2014ZX10003002)

102206 北京，中國疾病預防控制中心結核病預防控制中心 國家結核病參比實驗室(李強、趙冰、歐喜超、趙雁林)；安徽省胸科醫院檢驗科(包訓迪)；西安市胸科醫院檢驗科(劉元)

趙雁林，Email: zhaoyanlin@chinatb.org

2016-02-04)