腸桿菌肽的研究進展與應用

□莫丹 付超強 李萍萍 馮浩 (林州中農穎泰生物肽有限公司)

腸桿菌肽的研究進展與應用

□莫丹 付超強 李萍萍 馮浩 (林州中農穎泰生物肽有限公司)

1 腸桿菌肽概述

腸桿菌肽最早是由1993年美國普林斯頓大學從腸道細菌中分離出一類分子量小于2.5KD(千道爾頓），有著索套狀結構的抗菌多肽，其結構超級穩定，對酸、堿、溫度都有很好的耐受性，并將其命名為（Lasso Peptides）。

腸桿菌肽是由腸桿菌科細菌產生的抑制大腸桿菌和相關病株的經典細菌素抗菌肽。它是由腸桿菌屬的細菌產生的一類小分子量的抗菌肽，由于其抑菌能力強，引起國內外研究機構的廣泛關注。

其對大腸桿菌、沙門氏菌以及志賀氏菌具有很強的殺滅和抑制作用。研究發現，腸桿菌肽這種索套結構對于抗菌功能非常重要，用氨基酸合成的辦法合成的直鏈多肽沒有生物活性，而結構的改變都會造成抗菌活性的下降或消失。我們利用蛋白質工程技術在植物乳桿菌中實現了高效生產。

2 腸桿菌肽作用機制

目前認為，腸桿菌肽主要是通過兩種方式抑制病原微生物。

2.1 通過抑制RNA聚合酶活性來干擾細菌mRNA以及蛋白質的合成。

2.1.1 RNA聚合酶(RNAP)是細菌基因表達的關鍵酶，是一種極其復雜的分子機器。RNAP具有催化作用的核心部分由亞基 α2ββ‘ω組成，分子量為400KD。研究發現，當RNAP的β亞基發生突變后，其對腸桿菌肽產生耐受性，從而確定其靶位點為RNAP。

2.1.2 通過結構生物學發現，腸桿菌肽通過與二級通道結合發揮抑制作用，這種二級通道是由主要活性位點通道分支出來的次級通道，核苷酸底物通過這個通道進入到RNA聚合酶的作用位點。而腸桿菌肽與RNAP次級通道的結合會阻礙核苷酸進入酶的活性位點，從而抑制mRNA的形成和進一步蛋白質的合成。

2.2 通過改變細胞膜的通透性，從而使細菌細胞膜破碎，內容物外滲，病原細菌死亡。

2.2.1 腸桿菌肽對指數期生長的沙門氏菌和大腸桿菌的作用。加入1uM或者0.05uM的腸桿菌肽的沙門氏菌，觀察到細胞生存力的下降（4小時后有活力的細胞計數下降了3個數量級別，而當沙門氏菌從培養介質中移出后，清洗然后在培養基中重懸，細胞活力沒有恢復。

2.2.2 在沙門氏菌上進行的實驗表明，腸桿菌肽能顯著的抑制NADH和琥珀酸脫氫酶的活性改變氧氣的利用速度，而這兩個酶都是協助細胞膜穿膜的酶類。

2.2.3 因為呼吸功能依賴于完整和有功能的細胞質膜，故研究在腸桿菌肽作用下沙門氏菌膜的完整性。試驗采用熒光探針DiSC3，其能研究膜電勢的改變從而測定指數期生長細胞中敏感性。在對照實驗中，DiSC3的熒光性隨著時間有個重要的下降，顯示沙門氏菌在含有葡萄糖的介質中孵育，其細胞膜會發生極化。然而，當細胞與腸桿菌肽預孵化，與對照組相比，熒光下降的更慢一點，其原因是細胞膜是不完整的，膜電勢的改變敏感度下降。故我們可以確定，腸桿菌肽是通過這兩種方式來抑制和殺滅病原菌，首先通過改變膜通透性使細胞膜破損，隨后進入細菌內部與RNA聚合酶結合，抑制其轉錄和翻譯，從而使細菌破裂死亡。

腸桿菌肽是第一個發現的索套結構的多肽分子。而定的意義。腸桿菌肽是一種無溶血性，抗菌活性強，不易產生耐藥的抗菌肽，對于人類及動物抵抗病原菌具有重要意義。

3 腸桿菌肽在畜牧上的應用

3.1 腸桿菌肽與硫酸粘桿菌素對斷奶仔豬生產性能、腹瀉率和死亡率的影響（見表1）

試驗選擇150頭29日齡斷奶杜×長×大三元雜交仔豬，每個處理 5個重復，每個重復10頭仔豬，試驗期30天。結果發現，日糧中添加腸桿菌肽的斷奶仔豬從日增重、料肉比、腹瀉率等指標上來看均高于對照組，達到索套肽是目前抗菌肽領域研究的一大熱點，其抑菌機制與傳統的抗生素有所不同，不易產生耐藥性，其作為新藥開發來對抗細菌感染的潛力巨大。Fabian采用體內和體外評價腸桿菌肽對沙門氏菌的抑制作用，發現腸桿菌肽體外經過24小時在全血、血漿以及血清中保持完全活性，且不會出現溶血現象。與對照組比較，處理組會使全血、同源的血漿和血清中沙門氏菌的數量顯著降低。使用3毫克/鼠劑量的腸桿菌進行治療的小鼠的肝臟和脾臟中沙門氏菌活菌數顯著降低了2～3個數量級，且用24小時給藥和6天給藥方式的小鼠結果一致。說明腸桿菌肽能在體外和體內殺滅沙門氏菌。Sophie研究發現腸桿菌肽能抑制腹瀉型大腸桿菌O157，對于治療大腸桿菌引起的腹瀉具有一10%硫酸粘桿菌素的效果，綜合試驗結果說明腸桿菌肽可替代硫酸粘桿菌素，并促進斷奶仔豬生長。

表1 腸桿菌肽與硫酸粘桿菌素對斷奶仔豬生產性能、腹瀉率和死亡率的影響

表2 腸桿菌肽與硫酸粘桿菌素對保育豬生產性能的影響

表3 腸桿菌肽與喹乙醇對保育豬生產性能的影響

表4 腸桿菌肽對母豬生產性能的影響

表5 腸桿菌肽對AA肉雞生產性能的影響

3.2 腸桿菌肽與硫酸粘桿菌素對保育豬生產性能的影響（見表2）

108頭30日齡斷奶杜×長×大三元雜交仔豬，每個處理 6個重復，每個重復6頭仔豬，試驗期30天。結果發現，日糧中添加腸桿菌肽的保育豬從日增重、料肉比、腹瀉率、死淘率等指標來看結果均優于對照組，且個別指標優于硫酸粘桿菌素組。綜合試驗結果說明腸桿菌肽可完全替代硫酸粘桿菌素，并促進保育豬生長。

3.3 腸桿菌肽與喹乙醇對保育豬生產性能的影響（見表3）

84頭保育仔豬，隨機分為 3組進行試驗。結果發現，日糧中添加腸桿菌肽的保育豬，從日增重和料肉比來看，均高于對照組和喹乙醇組。綜合試驗結果表明腸桿菌肽可完全替代喹乙醇，并能促進保育豬生長。

3.4 腸桿菌肽對母豬生產性能的影響（見表4）

40頭配種時間接近、胎次大致相同、體重大致接近、健康狀況良好的長白×大約克經產母豬，隨機分為兩個處理，每個處理20頭。結果發現，日糧中添加腸桿菌肽能夠提高仔豬斷奶重和成活率，同時顯著改善仔豬的腹瀉問題，且對仔豬疾病起到一定的預防作用。

3.5 腸桿菌肽對AA肉雞生產性能的影響（見表5）

1日齡健康AA+肉雞4800只隨機分為兩個處理組，每個處理6個重復，每個重復400只，試驗期42天。結果發現，日糧中添加腸桿菌肽能夠增加肉雞出欄體重和平均日增重、降低死亡率、提高飼料的轉化率、提高肉雞的生產成績，改善肉雞的生產性能。

3.6 腸桿菌肽對仔豬黃痢的治療

用法用量：腸桿菌肽5毫克兌20毫升生理鹽水，每頭豬每次灌服3毫升，每天一次，連用3天，仔豬肛門周圍及產床上無黃色稀糞便。