Notch3在乳腺組織中的表達(dá)以及與乳腺癌癌變進(jìn)展的關(guān)系

杜小明　花本林　李玉聰　李怡曉　曹玉文

摘要：目的 檢測乳腺組織中Notch3的蛋白表達(dá)水平，以及分析其與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測了Notch3在癌旁正常乳腺組織和乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)水平，并且運(yùn)用統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)一步分析了Notch3表達(dá)水平和乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 Notch3的蛋白水平在乳腺癌組織中顯著高于癌旁正常乳腺組織，P=0.000；Notch3的蛋白高表達(dá)和乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，P=0.000，在TNM各分期中差異明顯，和更高的分期呈正相關(guān)，P=0.004；在病理學(xué)分級中差異明顯，和更高的分級呈正相關(guān)，P=0.035。結(jié)論 Notch3的高表達(dá)可能存進(jìn)乳腺癌的癌變和進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：Notch3；Notch信號通路；乳腺癌

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，也是威脅女性健康的主要原因之一，雖然隨著診斷及先進(jìn)治療手段的普及，乳腺癌的預(yù)后已經(jīng)較之前有了很大提升，但是乳腺癌整體的防治還亟需繼續(xù)探尋[1]。而近年來，研究乳腺癌的分子診斷標(biāo)記物和分子靶向治療成為一個(gè)重點(diǎn)趨勢。

Notch3是Notch受體家族中的一員，其位于19q12 染色體上，由 33 個(gè)外顯子組成，編碼1個(gè)由2321個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白受體，和家族其它成員相似，也是由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成，在和Notch家族配體結(jié)合后，激活Notch信號通路，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞生長發(fā)育、增殖和凋亡以及維持干細(xì)胞的作用[2]。進(jìn)來研究發(fā)現(xiàn)包括Notch3在內(nèi)的Notch信號通路的激活以及其活性分子的活化可以促進(jìn)肝細(xì)胞癌[3]、結(jié)腸癌[4]和卵巢癌[5]等腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展，特別是Hu C和Chen CF發(fā)現(xiàn)在乳腺癌小鼠模型和細(xì)胞株中，Notch3的過表達(dá)可以促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展[6-7]。于是本課題組設(shè)想在乳腺癌人組織中驗(yàn)證上述發(fā)現(xiàn)。

1資料與方法

1.1一般資料 收集2006年～2014年石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科被診斷為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌（IDC）的石蠟包埋組織標(biāo)本，共計(jì)90例，均為女性，年齡30～72歲，中位年齡55歲，平均年齡50歲，同時(shí)收集對照癌旁正常乳腺組織30例。所有樣本均由本科室2名高年資病理學(xué)醫(yī)師對HE染色切片進(jìn)行組織學(xué)觀察和復(fù)查診斷，并進(jìn)行分型、分級，其中TNM分期，0～Ⅰ期20例，Ⅱ期35例，Ⅲ期35例；病理學(xué)分級，高分化（Ⅰ級）乳腺癌13例，中分化（Ⅱ級）乳腺癌50例，低分化（Ⅲ級）乳腺癌27例。

1.2試劑 中性福爾馬林固定液、乙醇、二甲苯、枸櫞酸鹽、Z中性樹膠、DAB顯色液、H2O2均為國產(chǎn)產(chǎn)品。EnVision試劑盒購自于丹麥Dako公司，Notch3抗體購自abcam公司，克隆號為ab60087，抗體來源兔抗人，稀釋濃度為1：200。

1.3免疫組化染色 免疫組化采用Envision法。將烤好的切片依次輕放入二甲苯I、II、III中；然后將脫蠟后的切片按順序浸入裝有梯度乙醇溶液的液缸中；采用微波修復(fù)方法，將修復(fù)完的切片浸入新配制的3%甲醇雙氧水溶液中，室溫放置10min，然后用自來水沖洗1～2次；每張切片滴加已稀釋至最佳工作濃度的一抗各160μl，放入4℃冰箱過夜，孵育；將過夜后的切片從4℃冰箱取出，室溫放置10min；每張切片均滴加二抗各160μl，放入37℃恒溫箱，孵育30min；每張切片滴加1～2滴新配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察組織顯色情況；顯色完成后迅速用自來水沖洗，放入蘇木素中復(fù)染2.5min，鹽酸酒精分化4～6s，然后自來水中返藍(lán)3min；切片再次脫水、透明，中性樹膠封片。

1.4免疫組化結(jié)果評定 Notch3染色后出現(xiàn)細(xì)胞漿和/胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，參照許良中[8]等的方法， 再結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的評定標(biāo)準(zhǔn)，將切片中陽性細(xì)胞所占觀察細(xì)胞數(shù)的百分比≤10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，76%～100%計(jì)4分；著色強(qiáng)度無著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分，由兩項(xiàng)積分相加進(jìn)行評分；0～5分評為陰性表達(dá)（-），>6分評為陽性表達(dá)（+）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用四格表或列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)法，以α=0.05雙側(cè)檢驗(yàn)為檢驗(yàn)顯著性水準(zhǔn)，P<0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Notch3蛋白在癌旁正常乳腺和乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的表達(dá)

結(jié)果如圖1所示，Notch3蛋白表達(dá)定位于乳腺癌癌細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，染色顏色多為棕黃色和棕褐色，陽性細(xì)胞所占百分比多為>51%；而在癌旁正常乳腺組織中多無著色或淡黃色，陽性細(xì)胞所占百分比多<51%。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果見表1所示，Notch3蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌（IDC）和癌旁正常乳腺組織（ANBT）中陽性表達(dá)率分別為52.3%（47/90）和6.7%（2/30），采用χ2 檢驗(yàn)比較顯示，二者表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

圖 1 Notch3蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌（IDC）和癌旁正常乳腺（ANBT）的表達(dá)（EnVision×200 1：200）

2.2 Notch3蛋白表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果如表2所示，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性（-）和陽性（+）的患者中，Notch3蛋白表達(dá)率分別為18%（5/28）和68%（42/62），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；在0-I、II和III期的患者中，Notch3蛋白表達(dá)率分別為25%（5/28）、49%（17/35）和71%（25/35），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004）；在I、II和III級的患者中，Notch3蛋白表達(dá)率分別為23%（3/13）、52%（26/50）和67%（18/27），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.035）。

3 討論

Notch信號通路的激活與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，Notch 通路中有5種Notch 配體，包括Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3和Delta4，4種受體，包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。本實(shí)驗(yàn)組前期研究結(jié)果表明，Notch信號通路分子中的Notch1蛋白[9]、N1IC蛋白[10]和Snail蛋白[11]高表達(dá)分別與乳腺癌變、侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，說明三者可能促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程。課題組前期也在乳腺組織中檢測了Notch1、N1IC及Snail蛋白表達(dá)，得出結(jié)論與文獻(xiàn)結(jié)果一致。而除了Notch1，Notch3也被報(bào)道其高表達(dá)可能導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生[6-7]，并且預(yù)示著乳腺癌患者有著不佳的預(yù)后[12]，而這一些列促乳腺癌癌變的過程可能與Her-2、ER通路有關(guān)，抑制 Notch3信號通路可能是靶向治療乳腺癌的一個(gè)新的方向[13]。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Notch3蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中明顯高于癌旁正常乳腺組織，闡明高Notch3表達(dá)可能促進(jìn)乳腺癌的癌變，這也和前期在小鼠和乳腺癌細(xì)胞株中Notch3的研究相符[6-7]，Notch3信號通路的異常參與了乳腺癌的癌變進(jìn)展。接著我們在分析Notch3表達(dá)和乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，Notch3的高表達(dá)和乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更高的TNM分期和較差的分化分級呈正相關(guān)，提示Notch3的高表達(dá)和更差預(yù)后及惡性程度更高的乳腺癌聯(lián)系緊密，而且可能促進(jìn)了乳腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移。而且近期有研究揭示，Notch3的高表達(dá)和結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及更高的臨床分期呈正相關(guān)，在低分化卵巢癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移的卵巢癌中Notch3更易發(fā)現(xiàn)高表達(dá)。這些和我們的發(fā)現(xiàn)都進(jìn)一步提示我們，Notch3可能參與促進(jìn)乳腺癌的癌變和進(jìn)展，Notch3表達(dá)水平有可能作為預(yù)測癌癥侵襲轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)和對預(yù)后判斷具有一定價(jià)值。

當(dāng)然，本次實(shí)驗(yàn)仍存在著種種不足之處。首先，更多的樣本量需要被添加在今后的進(jìn)一步研究中，其次，在乳腺組織中除了檢測Notch3蛋白水平外，我們還可以在用RT-PCR方法檢測Notch3的mRNA水平，最后，當(dāng)前估算患者預(yù)后較精確的有總生存率和無病生存率，我們可以隨訪實(shí)驗(yàn)納入的乳腺癌患者的生存資料，進(jìn)行進(jìn)一步的生存分析。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果給予我們后續(xù)研究提供了一個(gè)基礎(chǔ)，也為Notch3可能作為一個(gè)潛在的乳腺癌診斷分子標(biāo)記物和靶向治療藥物提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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