基于雙向固體發(fā)酵技術(shù)的靈青菌質(zhì)發(fā)酵動態(tài)變化研究

劉學(xué)湘，陳建偉，蘇 潔

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)一級學(xué)科，江蘇 南京 210046)

馬兜鈴科植物青木香(Radixaristolochiae)是中醫(yī)臨床常用的一種中藥。作為理氣藥，中醫(yī)認(rèn)為它具有平肝止痛，解毒消腫的作用，用于眩暈頭痛，胸腹脹痛，癰腫疔瘡，蛇蟲咬傷。現(xiàn)代藥理[1-3]實驗證明具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解痙、降壓和抗菌等多種活性。青木香所含毒性成分為馬兜鈴酸類(aristolochic acid，AA)物質(zhì)，因“馬兜鈴酸腎毒性”導(dǎo)致2004年SFDA已取消了其藥用標(biāo)準(zhǔn)。鑒于此目前處方和制劑以土木香替代青木香，但文獻調(diào)研結(jié)果顯示土木香的植物來源、親緣關(guān)系、功效主治、化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用等方面都與青木香有很大的差異[4],所以替代使用仍存在一定爭議。目前對于含AA成分的藥物減毒主要采取炮制[5]和中藥配伍[6]等手段。本研究出發(fā)點基于上世紀(jì)80年代后期莊毅研究員提出的藥用真菌“新型固體發(fā)酵工程”的理論。前期實驗根據(jù)真菌與發(fā)酵基質(zhì)組合雙方的發(fā)酵情況，初步判定靈芝、紅栓菌、白僵菌、槐耳等13種真菌與青木香藥材基質(zhì)基本相適應(yīng)，組成13種發(fā)酵組合。本實驗研究的是靈芝菌與青木香的發(fā)酵組合產(chǎn)物靈青菌質(zhì)中基質(zhì)轉(zhuǎn)化率、總馬兜鈴酸和馬兜鈴酸Ⅰ的含量隨不同發(fā)酵時間的動態(tài)變化，為判定靈青菌質(zhì)的發(fā)酵終點及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了科學(xué)依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1 實驗材料

LC-10AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；UV-2401 PC紫外可見分光光度儀(日本島津公司);立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50KB(上海申安醫(yī)療器械廠)；超凈工作臺403(江蘇無錫縣空氣凈化設(shè)備廠)；隔水式電熱培養(yǎng)箱PYX-DHS(上海醫(yī)療器械七廠);SYZ-A石英亞沸高純水蒸餾器(江蘇金壇國勝儀器廠)；AE240電子天平(METTLER公司)；202型電熱恒溫干燥箱(上海索普儀器有限公司);FW80型微型高速萬能試樣粉碎機(河北省黃驊市齊家務(wù)科學(xué)儀器廠)。

青木香藥材，購自南京鹿江中藥飲片廠，批號：20070728，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為馬兜鈴科植物馬兜鈴AristolochiadebilisSieb.etZucc.的干燥根；馬兜鈴酸Ⅰ對照品，購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110746-200305，供含量測定用；靈芝菌種由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究中心提供。

乙腈為色譜純，自制重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 PDA斜面培養(yǎng)基配制及其靈芝菌的活化 按以下配方常規(guī)配制PDA斜面培養(yǎng)基，配方：馬鈴薯200 g(去皮切塊)，葡萄糖20 g，瓊脂18～20 g，加水至1 000 mL,pH自然。無菌條件下將靈芝菌接種于PDA斜面上，27～28 ℃避光培養(yǎng)4 d，待靈芝菌白色菌絲長滿斜面,取出，置4 ℃冰箱保存，待用。

2.2 青木香基質(zhì)的制備 將青木香粉碎，過10目篩，填裝干凈試管，加適量水濕潤，pH自然，混合均勻后，扎口，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻，待用。

2.3 固體發(fā)酵 從活化后的靈芝菌菌種斜面上切取一小塊菌絲連同培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入青木香基質(zhì)表面，扎口，置(28±1)℃培養(yǎng)箱中，定期觀察并記錄菌絲體生長情況。

2.4 靈青菌質(zhì)的處理 每隔1周從試管中掏出青木香的靈芝菌發(fā)酵產(chǎn)物,即靈青菌質(zhì)，置烘箱內(nèi)，60 ℃干燥，稱取菌質(zhì)干重，計算基質(zhì)轉(zhuǎn)化率(%)。基質(zhì)轉(zhuǎn)化率(%)=菌質(zhì)干重(g)/青木香基質(zhì)干重(g)×100%。

2.5 HPLC法測定馬兜鈴酸Ⅰ含量

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Water X Terra C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：乙腈-1%醋酸水溶液(51∶49)，流速:1.0 mL/min；檢測波長：315 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。該條件下對照品峰與樣品中其他色譜峰基本達(dá)到基線分離。

2.5.2 對照品溶液的制備 精密稱取馬兜鈴酸Ⅰ對照品4 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇約7 mL，置水浴上微熱使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，即得(每毫升含馬兜鈴酸Ⅰ為0.4 mg)。

2.5.3 線性關(guān)系的考察 精密吸取對照品溶液25、50、100、200、250 μL，分別置1 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度分別為10、20、40、80、100 μg/mL的馬兜鈴酸Ⅰ溶液。照前述色譜條件分別進樣10 μL，測定，記錄峰面積值(mAbs)。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、對照品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：回歸方程為Y=3.74×106X-13 916(r=0.999 5)，馬兜鈴酸Ⅰ在10～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.4 供試品溶液的制備 取干燥的靈青菌質(zhì)1 g，粉碎(過40目篩)，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中,加10倍量60%甲醇20 mL，浸泡30 min后，水浴回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣以甲醇定容至25 mL，0.45 μm濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.5.5 馬兜鈴酸Ⅰ的含量測定 精密吸取供試品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀中,按上述色譜條件測定，外標(biāo)法計算供試品中馬兜鈴酸Ⅰ的含量(mg/g)。

2.6 紫外分光光度法測定總馬兜鈴酸含量[7]

2.6.1 線性關(guān)系的考察 精密量取馬兜鈴酸Ⅰ對照品溶液(濃度為0.4 mg/mL)30、60、120、150、210 μL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度,搖勻(濃度分別為1.2、2.4、4.8、6.0、8.4 μg/mL)，照紫外分光光度常規(guī)法操作,在250 nm波長處測定樣品吸收度，以對照品吸收度(Abs)為縱坐標(biāo)、濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(C),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：回歸方程為A=0.100 7 C+0.001(r=0.999 2)，馬兜鈴酸Ⅰ在1.2 ～ 8.4 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

2.6.2 總馬兜鈴酸的含量測定 精密吸取上述供試品溶液(1 g→25 mL)60 μL,稀釋并定容至10 mL，混勻，參照以上測定方法,以甲醇為參比溶液，在波長250 nm處測定樣品吸光度值，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算供試品中總馬兜鈴酸的含量(%)。

2.7 實驗結(jié)果

2.7.1 不同發(fā)酵時間對青木香基質(zhì)轉(zhuǎn)化率的影響 以發(fā)酵時間(d)為橫坐標(biāo)，基質(zhì)轉(zhuǎn)化率(%)為縱坐標(biāo)，繪制靈芝菌發(fā)酵青木香的基質(zhì)轉(zhuǎn)化動態(tài)曲線(見圖1)。結(jié)果表明發(fā)酵至第28天靈青菌質(zhì)的重量小幅下降，第28～35天相對穩(wěn)定，此后菌質(zhì)重量又大幅下降。

圖1 靈青菌質(zhì)發(fā)酵時間-基質(zhì)轉(zhuǎn)化率的動態(tài)曲線圖

2.7.2 不同發(fā)酵時間對靈青菌質(zhì)中馬兜鈴酸Ⅰ含量的影響 以發(fā)酵時間(d)為橫坐標(biāo)，馬兜鈴酸Ⅰ含量(mg/g)為縱坐標(biāo),繪制靈芝菌發(fā)酵青木香的馬兜鈴酸Ⅰ含量動態(tài)曲線(見圖2)。HPLC法測定結(jié)果表明，第0～28天馬兜鈴酸Ⅰ的含量基本沒有變化;第28天后馬兜鈴酸Ⅰ含量開始明顯下降，直至第56天。各發(fā)酵時間點的樣品與發(fā)酵空白比較，馬兜鈴酸Ⅰ含量均有不同程度的下降。

圖2 靈青菌質(zhì)發(fā)酵時間-馬兜鈴酸Ⅰ含量的動態(tài)曲線圖

2.7.3 不同發(fā)酵時間對靈青菌質(zhì)中總馬兜鈴酸含量的影響 以發(fā)酵時間(d)為橫坐標(biāo)，總馬兜鈴酸含量(%)為縱坐標(biāo)，繪制靈芝菌發(fā)酵青木香的總馬兜鈴酸含量動態(tài)曲線(見圖3)。UV法測定結(jié)果表明，第0～28天總馬兜鈴酸的含量保持下降的趨勢,至第28～35天后總馬兜鈴酸含量基本保持恒定，35 d后總馬兜鈴酸含量又開始上升。各發(fā)酵時間點的樣品與發(fā)酵空白比較，總馬兜鈴酸的含量均有不同程度的下降。

圖3 靈青菌質(zhì)發(fā)酵時間-總馬兜鈴酸含量的動態(tài)曲線圖

3 結(jié)論

根據(jù)不同發(fā)酵時間基質(zhì)轉(zhuǎn)化率、馬兜鈴酸Ⅰ含量和總馬兜鈴酸的含量測定結(jié)果可判定第28～35天左右為靈芝菌發(fā)酵青木香的發(fā)酵終點。在合理的發(fā)酵周期內(nèi)，采用優(yōu)化可控的發(fā)酵參數(shù)進行固體發(fā)酵，可為靈芝菌固體發(fā)酵青木香獲得靈青菌質(zhì)的制備工藝提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

藥理實驗已證實發(fā)酵35 d的靈青菌質(zhì)與青木香藥材比較保持了較好的鎮(zhèn)痛與抗炎活性，且毒性明顯降低(另文發(fā)表)，說明運用雙向固體發(fā)酵技術(shù)靈芝菌發(fā)酵青木香的研究，確實達(dá)到了減毒持效的作用。該技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用，為含馬兜鈴酸類的中藥及其復(fù)方制劑的減毒研究提供借鑒。

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[5]王智民,由麗雙,姜旭,等.利用炮制技術(shù)去除關(guān)木通毒性成分的方法學(xué)研究[J].中國中藥雜志,2005,30(16):1243-1246.

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