分子生物學方法在土壤線蟲群落研究中的應用

李孟潔 張靖楠 劉君鋒 張鈺倩

摘 要 線蟲群落組成可作為評估土壤環境質量的一個重要指標。分子生物學手段為解決傳統形態學鑒定進行群落組成分析工作量較大，專業知識需求高，鑒定結果的一致性易受干擾等問題提供了新途徑，并具有樣品量小，檢測速度快，對近緣種區分度高等特點。

關鍵詞 線蟲多樣性；高通量測序；DGGE；分子生物學；遺傳標記

中圖分類號：S154 文獻標志碼：B 文章編號：1673-890X（2016）15--02

線蟲在土壤食物網中占據較為重要的地位，常以土壤微生物為食，在土壤有機質分解、養分循環、改善土壤結構以及植物演替中發揮著重要的作用，其群落組成的變化能夠反映所在生態系統的健康狀況[1]。

傳統的線蟲群落結構研究基于對土壤中線蟲的人工分離和形態學鑒定，往往需要研究者具備專業的分類學知識，同時耗費大量的時間和精力。而且，由于線蟲個體較小，物種的分類比較粗糙，往往只到科屬水平，使生態分析比較模糊或表面化。此外，由于提取方法和形態學分類依據的限制，科屬鑒定只能針對從土壤中獲取的很小一部分成年線蟲個體，很難反映全部土壤線蟲的狀態，且易受環境和人為因素的干擾，可能使后續群落結構和區系分析結果在平行試驗結果間缺乏一致性。

針對遺傳物質的分子生物學方法在分類學上的引入為解決問題提供了新的方法和思路。不同于傳統的形態學鑒定對常規物種描述性的評估，采用分子生物學方法能針對少量樣品進行分析，降低了勞動強度和對分類學專業知識的要求，提高了效率。此外，分子生物學技術也可以更容易地鑒定親緣種[2]，提高了研究的精度。本文針對線蟲群落結構分析中分子生物學的研究應用現狀進行概述，分析了各種方法的利弊，為線蟲分子生態學研究提供參考。

1 利用分子生物學方法對線蟲群落的分析

1.1 DNA條形碼技術

DNA條形碼技術能利用相對較短的標準DNA片段，進行種內特異性與種間多樣性的生物身份建立，實現了對物種快速、準確進行識別和鑒定[3]，可用于與生物分類相關的生態學、保護生物學等領域。基于DNA條形碼技術的線蟲分類學研究已經引起人們的關注。許多遺傳標記（Genetic Markers）已被用于線蟲的鑒定，包括SSU rDNA、LSU rDNA、ITS序列、COI等。

小亞基核糖體DNA（The ribosomal DNA small subunit，SSU rDNA）是最早用于標記的片段，目前應用較廣泛。它能有效描述某些線蟲但不能完全解釋形態學研究觀察到的結果。對于線蟲目和科水平的鑒定效果較好，但某些線蟲種無法用SSU進行區分。后來，人們嘗試用大亞基核糖體DNA（The ribosomal DNA large subunit ，LSU rDNA），但它需要多個區域的擴增是有效的。利用核糖體DNA內轉錄間隔區（The internal transcribed spacer，ITS）建立線蟲系統發育分類系統。線粒體細胞色素C氧化酶亞基I（Cyctochromec oxidase subunit I，COI）具有引物通用性高和進化速率快等優點，用于動物分類鑒定較為理想。當然，利用以上遺傳標記的條形碼技術都一些問題，如缺少同門范圍（phylum-wide）內的引物，很難找到適宜用做條形碼的單一基因片段以鑒定全球范圍內的線蟲種類，進而建立高通量測序的方法等。

1.2 PCR-DGGE

變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE）利用不同核酸序列或基因片段在變性梯度膠上電泳遷移率的不同將序列分開，可以直接切下凝膠條帶測序，進行群落內的系統發育分析。有研究探討使用PCR-DGGE法分析線蟲群落組成。Waite[4]等從草地土壤中直接提取環境DNA，針對SSU 18S rDNA序列，采用PCR-DGGC法研究土壤線蟲群落的多樣性，并獲得了某些屬線蟲的特異序列。但發現結果與之前進行的基于形態學分類的研究結果不一致。并且，從結果很難獲取有關的遺傳多樣性或任何特定的類群的相對豐度的信息。Wang[5]等采用該法和形態學鑒定相結合的方法對銅污染土壤中線蟲多樣性進行分析，結果表明，PCR-DGGE法對判別重金屬污染土壤中線蟲多樣性具有可行性。但PCR-DGGE法存在一些缺點，如PCR引物可能存在擴增的局限性；分離的DNA片段較小（最大為1 kb），序列信息有限；在不適宜的實驗條件下，序列不同DNA片段不能完全分開；只能檢測到環境中的優勢種群等。

1.3 PCR-TRLFP

末端限制性片段長度多態性分析（Terminal restriction fragment length polymorphism，TRFLP），在PCR擴增基礎上，根據限制性酶切片段長度差異來檢測生物群落差異的一種指紋分析方法。該方法可用于不同生境的線蟲群落研究。目前，已針對草地、農田、沙丘、森林及沼澤地等生態系統開展了相應研究[6-8]，并獲得了較理想的結果。TRFLP最主要的優點是能夠在不同序列運行中比較數據，不像DGGE在凝膠之間比較。片段可以被精確地控制在700bp左右；超過這個規定的相關片段可以被控制在1000bp大小，分辨率相對較高。在96或384孔板可以進行TRFLP，加上電子數據輸出和自動自如，這意味著它是高通量與快速數據分析結合的方法。但是由于限制性酶對擴增產物酶切得不完全，會存在高估生物群落的多樣性。

1.4 高通量測序

高通量測序在微生物生態學研究中已經取得了比較理想的結果。因此，有研究者將該方法引入線蟲多樣性的研究中。近幾年，二代測序技術（The next-generation sequencing，NGS），特別是454測序在線蟲多樣性研究方面取得了長足進展，定性或定量研究中，高通量測序結果都有比較好的一致性和重現性[9]。但也存在一些問題，例如，雖然線蟲的優勢種和常見種易被檢測，特定種屬的信息更加豐富，但還不能完全反映線蟲群落組成。現有引物不具有線蟲專一性，同時還會擴增出真菌、植物或其他后生動物的信息，易對聚類分析產生干擾。針對SSU rDNA的研究發現，先對土壤樣品中線蟲進行分離提取再進行測序，可以降低真菌或植物OUTs的干擾，但會使聚類結果偏向某些定的種屬或特定生長階段的線蟲；而直接從土壤中獲取線蟲DNA，又對引物的特異性有較高要求[10]。因此，線蟲DNA的提取方法，遺傳標價通用引物的選擇是下一步研究亟待解決的問題。

2 結語

雖然存在局限性，但分子生物學手段的應用拓寬了線蟲學研究的廣度和深度。有報道表明，傳統分類學與分子方法對于線蟲多樣性的研究結果的缺乏一致性，因此，建立傳統分類方法與分子方法的對應關系是研究的一個關鍵點，分子技術要能反映特定種或某功能團的相對多度。此外，高通量測序可以實現同時對多個土樣樣品的土壤線蟲進行大規模分析，但目前方法尚不成熟，未來基于遺傳標記的高通量基因組研究將線蟲生態學的發展方向之一。傳統分類學是分子手段的基礎，分子方法對大樣本的分析更加簡便，二者彼此促進，必將推動土壤線蟲分類學及群落研究的發展。

參考文獻

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[8]Donn， S. A Novel Molecular Approach for Rapid Assessment of Soil Nematode Assemblages-variation， Validation and Potential Applications[J].Methods in Ecology and Evolution，2012，3（1）：12-23.

[9]Porazinska D.L. Reproducibility of Readnumbersin High-throughput Sequencing Analysis of Nematode Communitycompositionand Structure[J].MolEcolResour，2010（10）：666-676.

[10]Sapkota R.High-throughput Sequencing of Nematode Communities from Total Soil DNA Extractions[J].BMC Ecology，2015，15（1）：1-8.

（責任編輯：劉昀）