人胰島素MIP融合蛋白在大腸桿菌中表達條件的優化

黃旋 陳婷 張云龍 陸昌瑞

摘 要：MIP即人胰島素B27賴氨酸去三肽胰島素 （B27K-DTrI）的前體。B27K-DTrI是一種新型單體速效胰島素類似物，其單體性質好，生物活性高，是潛在的速效人胰島素藥物。將構建好的重組質粒ppSUMO-MIP轉入大腸桿菌BL21（DE3）菌株，利用IPTG進行誘導表達。對MIP融合蛋白的誘導表達時間進行一系列的優化，結果表明：重組質粒在大腸桿菌BL21（DE3）中最優的表達條件為TB培養基、0.1 mM IPTG，15 ℃誘導過夜。通過表達條件的優化，每升菌液可獲得30.1 mg的融合蛋白粗品。為進一步制備單體胰島素B27K-DTrI打下了基礎。

關鍵詞：速效胰島素；SUMO-MIP融合蛋白；表達優化

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160333046

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，它現已成為威脅人類健康的最大殺手之一[1]。胰島素是由胰腺β細胞分泌產生的一類多肽類激素，是體內重要的降低血糖激素[2-3]。胰島素從問世至今經歷了從動物胰島素、人胰島素到胰島素類似物的3大跨越[4-6]。20世紀90年代，人們利用基因工程技術對人胰島素的氨基酸序列及結構進行局部修飾，合成了人胰島素類似物，改變了胰島素的藥代動力學特征。速效胰島素是一類通過基因工程方式獲得，與餐后正常人體內胰島素分泌代謝最為接近的胰島素類似物[7]。近年來，速效胰島素以其吸收快、安全性好等特點受到越來越多研究者的關注。

MIP即人胰島素B27賴氨酸去三肽胰島素（B27K-DTrI）的前體，是2005年由丁金國等人利用甲醇酵母表達系統成功制備的單體速效胰島素類似物[8]。B27K-DTrI具有單體性質好，生物活性高等特點，是一種新型的速效胰島素類似物。但是，由于其產量較低限制了B27K-DTrI的產業化。在前期研究中，研究者嘗試使用甲醇酵母表達系統和大腸桿菌IMPACT-TWIN系統進行重組制備B27K-DTrI。研究結果表明利用甲醇酵母表達系統進行制備其純化過程繁瑣，得率較低，而大腸桿菌IMPACT-TWIN系統進行制備必須經歷復性過程，不僅降低最終產量，而且對蛋白的生理活性也會產生潛在的影響 [9]。因此，試圖通過增加MIP前體表達量的方法來提高B27K-DTrI的最終產量。

利用大腸桿菌ppSUMO表達系統制備B27K-DTrI。ppSUMO表達系統是大腸桿菌表達系統的一種，通過融合表達SUMO肽可以明顯提高重組蛋白的可溶性[10-11]，避免在表達過程中出現包涵體，從而增加蛋白的可溶性表達量。在制備B27K-DTrI前體MIP融合蛋白的過程中，對MIP融合蛋白在大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中的表達條件進行優化，改善了表達過程中的誘導溫度、誘導劑濃度以及培養基條件，使得MIP融合蛋白產量得到提高（30.1 mg/L），為進一步制備單體胰島素B27K-DTrI打下了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株和載體：大腸桿菌BL21（DE3）細胞、ppSUMO-MIP質粒（經測序、鑒定無誤）均為本實驗室保存。

主要試劑：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素、NC膜、Terrific Broth（TB）、Ni-NTASefinoseTM Resin、蛋白質Marker均為生工生物產品，Yeast extra、Tryptone購自Oxoid公司，抗體6*His單克隆抗體購自proteintech。其他試劑均為國產分析純。

主要儀器：搖床、Western轉膜、凝膠成像儀（Bio-Rad）等。

1.2 方法

1.2.1 不同IPTG濃度對融合蛋白表達的影響

陽性克隆經測序鑒定正確后，接種到5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養基（1 % tryptone， 0.5 % yeast extract， 1 % NaCl， w/v）中，于37℃、225rpm條件下振蕩培養過夜，次日按體積比l：100的比例接種到5 mL新鮮的LB培養基中（含50 μg/mL卡那霉素），37℃，225 rpm搖床培養2 h，分別加人終濃度為0.1 mM，0.5 mM， 1 mM的誘導劑IPTG。37 ℃繼續培養4 h。誘導前后樣品進行12 % SDS-PAGE鑒定。

1.2.2 不同誘導溫度對融合蛋白表達的影響

細胞與37 ℃搖床培養至OD600=0.5后，加入終濃度為0.1 mM的IPTG，分別在37℃誘導8 h，在15 ℃條件下誘導過夜，離心收集菌體，高壓破碎細胞后離心分離上清和沉淀，進行12 %SDS-PAGE及western鑒定。

1.2.3 不同培養基對融合蛋白表達的影響

分別使用LB及TB（4.76 % Terrific Broth， w/v）培養基中，在0.1 mM IPTG條件下，15 ℃誘導過夜。離心收集菌體，高壓破碎細胞后離心分離上清和沉淀，進行12 %SDS-PAGE鑒定。

1.2.4 融合蛋白的親和純化

誘導培養的細胞離心收集后，高壓破碎細胞，10000×g ，30 min離心細胞裂解液。將上清樣品上樣至預先平衡好的Ni-NTA SefinoseTM resin中，依次用5倍柱體積（5 CV）的漂洗緩沖液 （25mM Tris-HCl，200mM Nacl，20 mM咪唑，pH8.0），5 CV 洗脫緩沖液 （25mM Tris-HCl，200mM Nacl，250 mM咪唑，pH8.0） ，5 CV再生緩沖液（25mM Tris-HCl，200mM Nacl，1 M咪唑，pH8.0） 處理柱子。所有樣品使用12 %SDS-PAGE鑒定分析。

1.2.5 濃度計算

使用Bradford試劑測定親和純化的蛋白樣品，計算蛋白濃度。

2 結果與討論

2.1 SUMO-MIP重組蛋白在大腸桿菌的表達

對重組質粒進行快速誘導表達，實驗結果如圖1（條帶1和4）所示。圖中可以看到構建的質粒可表達，但是融合蛋白的表達量偏低，所以在后續的實驗中需要對融合蛋白的誘導表達條件進行優化。

2.2 SUMO-MIP重組蛋白在大腸桿菌中的表達條件的優化

從快速誘導結果得出質粒可表達，但是融合蛋白表達量偏低，無法滿足后續的實驗要求，所以對誘導溫度、誘導劑濃度以及培養基條件做一系列的優化。

2.2.1 不同IPTG濃度對融合蛋白表達的影響

融合蛋白在37 ℃誘導溫度，不同濃度IPTG（0.1 mM， 0.5 mM， 1 mM）誘導下，全部都有表達。誘導劑濃度的增加并不增加目的蛋白的表達量，反而有下降的趨勢（圖1）。這可能是因為過高濃度的IPTG影響了細胞的生長狀態，從而影響融合蛋白的表達。根據上述實驗結果，確定SUMO-MIP融合蛋白誘導表達的最佳IPTG濃度是0.1 mM。

2.2.2 不同誘導溫度對融合蛋白表達的影響

在0.1 mM IPTG誘導下，分別在15 ℃和37℃誘導重組蛋白。誘導樣品分別進行SDS-PAGE及wetern blot鑒定。從圖2可以看到，SUMO-MIP融合蛋白的大小約為20kDa，與理論值一致。在0.1 mMIPTG濃度下，37 ℃和15 ℃均有融合蛋白的表達。特別是在15 ℃誘導條件下，western檢測到的目的蛋白條帶單一，均存在于破菌上清液中，說明在此條件下，融合蛋白具有很高的可溶性。所以SUMO-MIP融合蛋白的最優誘導溫度為15 ℃。

2.2.3 不同培養基對融合蛋白表達的影響

為了提高蛋白表達量，使用不同的培養基去誘導表達蛋白。分別使用LB及TB培養基，在0.1mM IPTG條件下，15 ℃過夜誘導融合蛋白，并進行親和純化。從SDS-PAGE電泳結果（圖3）分析，使用TB培養基后，在破菌上清和沉淀中均有融合蛋白的出現，通過親和純化洗脫下來的蛋白量，TB培養基遠遠高于LB培養基。所以融合蛋白誘導表達的最優培養基是TB培養基。

2.2.4 親和純化

在TB培養基，0.1 mM IPTG濃度下，15 ℃誘導過夜的條件下，對蛋白進行了初步的親和純化。通過親和純化的電泳圖（圖4）分析，得到了純度約70 %的融合蛋白粗產物（條帶7），通過Bradford發測定蛋白濃度，1 LTB培養基誘導，可以得到30.1 mg的融合蛋白粗產物。基本滿足后續的實驗需求。

3 結 論

B27K-DTrI是一種新型單體速效胰島素類似物，其單體性質好，生物活性高，是潛在的速效人胰島素藥物。MIP是B27K-DTrI胰島素的前體。提高MIP的表達量、簡化純化操作是實現B27K-DTrI產業化的實驗基礎。

利用ppSUMO表達系統，通過對ppSUMO-MIP誘導表達條件摸索及優化，得到了SUMO-MIP融合蛋白的最佳誘導表達條件：使用TB培養基，0.1 mM IPTG濃度下，15 ℃誘導過夜。其大大提高了蛋白的表達量，1 L細胞可以得到約30.1 mg純度約75 %的粗產物。融合蛋白的可溶性大大提高，在后續的實驗中無需對蛋白進行復性。

參考文獻

[1] “Update 2014”. IDF. International Diabetes Federation. Retrieved 29 November 2014.

[2] Wright JR， Yang H， Hyrtsenko O， et al. A review of piscine islet xenotransplantation using wild-type tilapia donors and the production of transgenic tilapia expressing a “humanized” tilapia insulin.[J]. Xenotransplantation. 2014，21（6）：485-495.

[3] Sonksen P ，， Sonksen J ，. Insulin： understanding its action in health and disease.[J]. British Journal of Anaesthesia， 2000， 85（1）：69-79（11）.

[4] 李玉珍.胰島素制劑的發展與安全[C].2011紫禁城國際藥師論壇暨中日藥師研討會，2011.

[5] 楊兆軍，楊文英.胰島素制劑的發展[J].中國糖尿病雜志，2013（5）.

[6] 王戰強.胰島素及其合成技術應用與發展[J].中國醫藥導報，2011， 08（13）：11-12.

[7] Mooradian A D， Marla B， Albert S G. Narrative review： a rational approach to starting insulin therapy.[J]. Annals of Internal Medicine， 2006， 145（2）：125-134.

[8] Ding J G， Jian F， Gui D F， et al. Expression of Monomeric Insulin Precursor in Pichia pastoris and Its Conversion into Monomeric B27 Lys Destripeptide Insulin by Tryptic Hydrolysis[J]. Acta Biochimica Et Biophysica Sinica， 2005， 37（4）：234–240.

[9] Ting C， Lujuan L， Helong H， et al. Preparation of monomeric B27 Lys destripeptide insulin by intein mediated expression in Escherichia coli[J]. Protein Expression & Purification， 2011， 80（1）：152-156.

[10] Malakhov M P， Mattern M R， Malakhova O A， et al. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins[J]. Journal of Structural & Functional Genomics， 2004， 5（1-2）：75-86.

[11] Marblestone J G， Edavettal S C， Lim Y， et al. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems： enhanced expression and solubility with SUMO.[J]. Protein Science， 2006， 15（1）：182-189.

作者簡介：黃旋（1989-），江蘇南通人，東華大學化學化工與生物工程學院在讀碩士研究生，研究方向：蛋白質結構與功能；通訊作者：陸昌瑞（1983-），上海人，東華大學化學化工與生物工程學院，教授，研究方向：核酸與結構生物學。