醫學微生物實驗常用教學菌種保存方法的比較

宋富成

【摘要】目的：探索最適宜的教學菌種的保存方法。方法：采用六種方法將細菌保存一年，復蘇后比較各保存方法后菌種的存活率和生化指標等。結果：用脫脂牛奶冷凍干燥保存法、脫脂奶粉冷凍干燥保存法保存菌種1年后存活率高達100%，且菌種的形態和生物學特性未改變。濾紙片低溫冷凍保存法、甘油原液低溫冷凍保存法保存菌種1年后菌種存活率為94.62%，保存液低溫冷凍保存法保存菌種1年后存活率在99% 以上，半固體低溫冷凍保存法保存菌種1年后存活率僅為66.54%。結論：脫脂牛奶冷凍干燥保存法、脫脂奶粉冷凍干燥保存法較其他保存菌種方法時間長，可用于各菌種保存，穩定性好，存活率高，適用于有條件的實驗長期保存菌種。

【關鍵詞】菌種保存；保存方法；比較

菌種作為一項重要的生物資源，是醫學微生物教學和研究的重要工作，同時與臨床疑難菌株的鑒別分離有著密切聯系。菌種保存方法因菌種而已，適宜的保存方法不僅可以保證細菌的存活，而且能保證細菌在形態、毒性及生化指標的穩定。本實驗在比較各菌種保存方法優缺點的基礎上，探索合適的菌種保存方法，選擇簡單易操作，對設備要求低的菌種保存方法以用于微生物的實驗教學。

1材料與方法

1.1 材料

（1）供試菌種： 金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、傷寒沙門菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、乙型副溶血性鏈球菌、變形桿菌等。（2） 培養基： 普通營養瓊脂、半固體、血瓊脂培養基。（3）1.5ml EP管，2ml凍存管。（4）標簽紙，封口膠布。（5）真空冷凍干燥機，-70℃ 冰箱。

1.2 保存方法

濾紙片保存法[1]：打孔器制取d=3mm圓形濾紙片，10ml普通試管加塞高壓消毒滅菌備用，用滅菌鑷子夾取濾紙片于平板上正反面蘸取待保存菌種的純菌落1-2個。放于高壓消毒滅菌后的1.5ml EP管再用封口膠帶將蓋邊緣封好于-70℃冰箱保存。

甘油原液保存法：將純化后的待保存菌種，用高壓消毒滅菌后的濾紙片正反面蘸取1-2個菌落，置于1.5ml EP管中，滴加0.3ml甘油原液，膠帶將蓋邊緣封好于-70℃冰箱保存。

菌種保存液法：配制：K2HPO4?：12.6g，檸檬酸鈉0.98g，MgSO4·7H2O：0.18g，KH2PO4： 3.6g，甘油88g加蒸餾水至1000ml，121℃滅菌30分鐘，4℃保存備用[2]。將細菌接種于普通瓊脂平板或血平板，37℃培養24h后，加入3ml備用的菌種保存液，刮取菌落，洗下菌苔充分混勻。微量加樣器取0.5ml菌液分裝于2ml凍存管中，將蓋擰緊于-70℃冰箱保存。

半固體保存法：將普通瓊脂高壓消毒滅菌后，無菌環境下取1ml分裝2ml凍存管中，加蓋備用。將待保存的菌種平板劃線分離后，用接種針取單個菌落穿刺接種到備用的半固體培養基中，加蓋擰緊在37℃ 下培養24h后，存放于-70℃冰箱保存。

脫脂牛奶冷凍干燥法[3]：鮮牛奶煮沸，冷卻脫脂，8磅15min滅菌備用。取3ml脫脂牛奶加入待保存菌種平板內，用取菌環刮取菌落，輕輕磨勻。以微量加樣器量取0.3ml脫脂牛奶菌懸液加入2ml凍存管，加蓋擰緊4℃冰箱保存20min，再轉到-20℃冰箱速凍30min.取出后，將蓋稍擰松放于真空冷凍干燥機中，真空干燥24h。冷凍干燥結束后，將蓋擰緊，于-70℃冰箱保存。

脫脂奶粉冷凍干燥法：配備15%奶粉乳液，煮沸冷卻脫脂，8磅15min滅菌備用。取3ml脫脂奶粉乳液加入待保存菌種平板內，用取菌環刮取菌落，輕輕磨勻。以微量加樣器量取0.3ml菌懸液加入2ml凍存管，加蓋擰緊4℃冰箱保存20min， 再轉到-20℃冰箱速凍30min。取出后，將蓋稍擰松放于真空冷凍干燥機中，真空干燥24h。冷凍干燥結束后，將蓋擰緊，于-70℃冰箱保存。

1.3 活力檢測方法 分別于保藏后3、6、9、12個月進行復蘇。從-70℃取出一套保存的菌種，37℃水浴快速解凍，根據菌種不同特性，選擇不同培養基復蘇，檢測細菌的存活情況，計算存活率[4]。并結合教學實驗進行細菌的形態、染色特性觀察、生化反應指標檢測和毒力的檢測等，比較各教學菌種生物特性是否發生變化。

存活率=（菌株存活數/受檢菌株數）×100%

2結果

6種方法保存1年后存活數量及存活率見表1。統計學分析，各組在存活率存在差異。脫脂牛奶冷凍干燥法和脫脂牛奶冷凍干燥法保存效果最好，復蘇后全部存活，在細菌的形態、染色特性觀察、生化反應指標檢測和毒力的檢測方面未發生改變。保存液法也能起到較好的保存作用，在短期保存效果上與以上兩種方法相同。濾紙片法和甘油原液法在存活率及各項檢測指標并無差異。半固體法一年內存活效果最差，復蘇后細菌形態發生改變，部分生化指標異常。

3討論

菌種保存是醫學微生物教學必不可少的工作，菌種保存的目的不僅是保持菌種的活性，還要維持各菌種的典型生物學特性、形態，盡可能的不發生或少發生變異。

本實驗表明濾紙片低溫冷凍法保存菌種，操作方便、所需材料簡單、菌種復蘇便捷，保存時間長，也可避免因反復傳代而造成的菌種生物學特性的改變，適用于一般醫學微生物實驗室保存營養要求條件不高的菌種。保存液低溫冷凍保存法制作簡單，不需要特殊設備，且不需要經常接種，可保存數年，但要注意保存的時候需直立存放。甘油原液低溫冷凍法，細菌在低溫高滲下代謝率低，甘油的保護緩沖作用有利于細菌的穩定性，不易發生變異，保持個菌種的生物學特性，而且操作簡單，保存時間較長。半固體瓊脂低溫冷凍法，該方法簡單易操作，技術要求不高，且復蘇簡單，但該方法適用于抵抗力較強、營養要求不高的菌種保存，保存時間較短，需反復傳代接種保存，易造成菌種變異，適用實驗室短期保存。真空冷凍干燥低溫保存法保存時間長，生物學特性不易發生變性，牛奶和奶粉保存菌種無材料差異，但操作過程復雜、難度大，需要較長時間才能完成，所需的真空冷凍干燥機一般實驗室難以配備，所以此方法適合于有條件的實驗室對菌種的長期保存。

綜上所述， 一般微生物實驗室對教學菌種的保存，可采用保存液低溫冷凍法，此方法操作簡單，且無需專業設備，可保存數年，復蘇方便。有條件的實驗保存教學菌種，可采用真空冷凍干燥低溫法，此方法要求較高的實驗設備，操作過程雖繁瑣，但保存時間可長達數十年，無需反復接種保存，菌種特性穩定且不易發生變異，該方法最適合醫學微生物教學菌種的保存。

【參考文獻】

[1] 彭俊華，薛榮麗，張媛媛，朱曉紅. 三種常用方法保存臨床常見菌種的比較 [J]. 甘肅科學學報，2012， 24（3）：88-90.