β—甘露聚糖酶基因的克隆及原核表達載體的構建

張云暉　關珍貞　王霞

摘要：目的：克隆β-甘露聚糖酶基因并構建其原核表達載體。方法：提取地衣芽孢桿菌ATCC 14580基因組，PCR法擴增該菌基因組中的β-甘露聚糖酶基因，與表達載體pET-28a連接并轉化到E.coli BL21中，構建原核表達載體，并對陽性重組菌進行PCR和酶切鑒定。結果：成功克隆β-甘露聚糖酶基因并構建其原核表達載體，β-甘露聚糖酶基因全長1008bp，編碼336個氨基酸，蛋白質分子量約為38KDa。SDS-PAGE檢測顯示重組酶分子量約為38KDa。結論：成功構建β-甘露聚糖酶基因的原核表達載體為基因的重組表達奠定基礎。

關鍵詞：地衣芽孢桿菌；β-甘露聚糖酶基因；克?。辉吮磉_載體

項目基金：吉林農業科技學院校級微生物重點學科培育項目（編號：吉農院合字〔2013〕第X006 號）；大學生科技創新科研項目（編號：吉農院合字〔2009〕第112號）

中圖分類號： Q943.2 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.11.023

β-甘露聚糖酶（β-mannanase，EC.3.2.1.78）是一類半纖維素水解酶，能夠催化甘露多糖（如半乳甘露聚糖、甘露聚糖等）的β-1，4甘露糖苷鍵隨機水解，生成一系列低分子量的寡糖[1]。作為一種新型的酶制劑，β-甘露聚糖酶已經廣泛應用于醫藥、食品、飼料、紡織、印染、洗滌、農業、造紙、石油開采及環境治理等諸多領域[2]。

對β-甘露聚糖酶的早期研究主要集中在產酶菌株的選育、提純、發酵條件優化等方面，隨著分子生物學技術的飛速發展，自20世紀90年代起，人們開始在分子水平上研究β-甘露聚糖酶，并迅速取得了豐碩的成果，目前已有多種微生物來源的β-甘露聚糖酶基因被分離、克隆，甚至實現異源表達[3，4]，但是關于地衣芽孢桿菌ATCC 14580 β-甘露聚糖酶基因的克隆及異源表達則尚無報導。本研究克隆了產地衣芽孢桿菌ATCC 14580 β-甘露聚糖酶基因，并構建其原核表達載體，為研究β-甘露聚糖酶的分子遺傳學基礎，開辟β-甘露聚糖酶工業化生產的新途徑，提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與載體 地衣芽孢桿菌ATCC14580購自上海北諾生物科技有限公司，E.coli BL21為實驗室保存，pMD18-T質粒購自寶生物工程（大連）有限公司，pET-28a質粒購自上海佳和生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 Bam HⅠ、HindⅢ、T4 DNA 連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA marker，均購自寶生物工程（大連）有限公司，IPTG購自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他試劑均為國產分析純，培養基為常規LB培養基。

1.2方法

1.2.1 β-甘露聚糖酶基因的克隆 參照精編分子生物學實驗指南的方法提取地衣芽孢桿菌ATCC 14580的基因組[5]。根據已報道的地衣芽孢桿菌ATCC 14580全基因組序列以及其它芽孢桿菌的β-甘露聚糖酶基因序列，利用LaserGene軟件尋找地衣芽孢桿菌ATCCC14580的β-甘露聚糖酶基因序列，并設計引物，引物中分別加入Bam HⅠ和HindⅢ（下劃線部分）的酶切位點，引物序列分別：5'-GGATCCACACCGTT

TCTCCGGTG -AAC-3'，5'-AAGCTTCCACGA CAGGCGT。

以地衣芽孢桿菌ATCC14580基因組為模板，擴增β-甘露聚糖酶基因。PCR反應體系為：94℃預熱5分鐘；94℃，45 秒，50℃，45秒，72℃，1分鐘，30個循環；最后，72℃延伸10分鐘?；厥誔CR產物并與pMD18-T載體連接，重組DNA轉化至E.coli DH5α中，進行藍白斑篩選，提取白色菌落質粒，送上海生物工程技術服務有限公司測序，同時進行PCR驗證[6]。

1.2.2 β-man基因原核表達載體的構建 用BamHⅠ、HindⅢ分別雙酶切pET-28a質粒和經驗證正確的克隆基因，回收酶切后的大片段，用T4 DNA liganase連接，重組DNA命名為pET-28a-man，轉化到E.coli BL21中，在含有卡那霉素的LB培養基中初篩陽性重組菌，提取質粒進行PCR和酶切鑒定。

2 結果分析

2.1 β-man基因的克隆

PCR產物電泳結果如圖1所示，擴增產物約為1008bp的基因片段，條帶單一，特異性強，與預期1008bp大小一致。

2.2重組克隆質粒pMD18-T-man鑒定

測序結果表明該基因全長1008bp，DNA MAN 軟件分析出該基因編碼336個氨基酸，分子量約為38KDa。以初篩陽性重組菌質粒為模板，進行PCR擴增并電泳檢測，結果如圖2所示，PCR產物為大約1008bp的DNA片段，與預期大小一致，表明pMD18-T-man構建成功。

2.3 原核表達載體pET-28a-man鑒定

提取抗性初篩存活的E.coli BL21質粒，并以其為模板進行PCR鑒定，結果如圖3所示，獲得了大小約1008bp DNA片段，說明構建的重組載體中含有β-man基因。BamHⅠ和HindⅢ雙酶切重組質粒并電泳檢測，分別獲得了一大一小兩個DNA片段，大片段為5343bp的pET28a部分片段，小片段為克隆的β-man基因，說明原核表達載體pET-28a-man構建成功。

3 討論

β-甘露聚糖酶在自然界中廣泛存在，目前在動物、植物和微生物中都有發現，其中微生物是該酶的主要來源，也是工業化生產β-甘露聚糖酶的主要來源[7]。研究發現，β-甘露聚糖酶在原始菌株中一般分泌量比較低，提純困難，因此，利用基因工程技術克隆β-甘露聚糖酶基因，并使之在大腸桿菌、酵母等細胞中高效穩定表達是該酶生產的有效途徑[8]。本研究首次將地衣芽孢桿菌ATCC14580的β-甘露聚糖酶基因與原核表達載體pET-28a連接，并轉入E.coli BL21中，成功構建了該基因的原核表達載體。后續將研究該基因在重組菌中的原核表達和酶學性質，并對其發酵條件進行優化，以期獲得高產量、高品質β-甘露聚糖酶。

參考文獻

[1]Schombug D， Salzmann M. Enzyme handbook（04） [M].Berlin：Springer Verlay Berlin Heideberg， 1991，1-5.

[2]李劍芳，鄔敏辰，夏文水.微生物β-甘露聚糖酶的研究進展[J].江蘇食品與發酵，2004，118（03）：4-9.

[3]Ma Y H， Xue Y F， Dou Y T， et al. Characterization and gene cloning of a novel β-mannanase from alkaliphilic Bacillus sp.

N16-5[J]. Extremophiles，2004，8（06）： 447-454.

[4]劉小丹，楊培龍，劉永超，等.一種來源于Paenibacillus sp.A1的中性β-甘露聚糖酶基因克隆及其酶學性質研究[J].中國農業科技導報，2009，11（05）：60-65.

[5] F M·奧斯伯， R·布倫特， R E·金斯頓， 等. 精編分子生物學實驗指南[M]. 北京： 科學出版社，1998.

[6]何冬蘭，張瑩，彭寶玉.重組谷氨酞胺轉胺酶基因的原核表達研究[J]. 中南民族大學學報（自然科學版），2010，29（4）：32-36.

[7] Hasan F， Ali Shah A， Javed S， et al. Enzymes used in detergents： Lipases[J]. African Journal of Biotechnology， 2010，9（31）： 4836-4844.

[8]龔月生，劉錦妮，王晶.耐熱盡半乳糖普酶基因在大腸桿菌中的表達及酶學性質研究[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2008，36（10）：59-65.

作者簡介：張云暉，吉林農業科技學院，在讀本科生，研究方向：分子生物學。

通訊作者：王霞，碩士，吉林農業科技學院，講師，研究方向：

分子生物學。