海洋真菌MF—08產殼聚糖酶誘導條件及酶學性質分析

李佳茵　王慧敏　祖國仁

摘要：通過研究不同搖床轉速、不同碳源和碳源濃度、不同誘導碳源對海洋真菌MF-08產殼聚糖酶的影響，提高其產酶活性，并對海洋真菌MF-08產殼聚糖酶進行部分酶學性質研究。結果表明，最佳發酵條件為27℃，150 r/min，1.5%蔗糖，0.01%氨基葡萄糖，海水培養基發酵72h。該殼聚糖酶的最適作用溫度為40℃，最適pH 5.2，酶活在pH 4.0～6.0范圍內和0～40℃相對穩定；Cu²⁺、Fe³⁺和Hg²⁺對該酶活具有明顯的抑制作用。經過培養條件的優化，該菌的最高產酶活性達到1.769 U/mL，與優化前相比提高了7.56倍。

關鍵詞：海洋真菌MF-08；殼聚糖酶；誘導條件；酶學性質

殼寡糖是甲殼素脫乙酰化后的產物，是一種具有獨特生理活性的低聚糖，屬于陽離子型天然堿性多糖，這使得殼聚糖具有許多特殊的物理、化學性質及生理和藥理功能。具有抗腫瘤、抗菌、免疫激活等獨特的生理功能，其應用前景廣闊。殼聚糖在自然界廣泛存在于蝦、蟹及少數菌類、藻類的細胞壁中，在高等植物中還未發現殼聚糖的存在，也可由幾丁質通過部分或完全脫乙酰而成，在食品、醫藥、農業和環保等領域有著廣泛的應用價值。降解殼聚糖的方法有化學法、物理法、酶解法、電化學法等，其中酶解法具有特異性強、節能、環保、安全等優勢。殼聚糖酶是一種降解殼聚糖的專一性水解酶，是理想的殼聚糖降解方法。利用酶法降解殼聚糖的研究還處在實驗室研究階段，難以實現工業化生產，關鍵在于尚未研究出有效獲得大量的、專一性的殼聚糖酶制劑的方法。

本試驗以一株產殼聚糖酶活力較高的海洋真菌為出發菌株，研究其培養條件對產酶的影響及殼聚糖酶學性質的研究，以期為殼聚糖酶工業化生產及應用提供試驗依據和理論基礎。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種 海洋真菌MF-08：大連工業大學微生物實驗室分離保存。

1.1.2培養基 試管斜面培養基：1.0%葡萄糖，0.5%殼聚糖，0.2%蛋白胨，0.1%酵母膏，40%蒸餾水，60%陳海水，2%瓊脂，自然pH，115-120℃，滅菌20 min，冷卻待用。

發酵培養基（g/L）：碳源1.0%；酵母膏0.1%；蛋白胨0.5%：FePO₄0.01%：陳海水100 mL；pH 7.6；在115-121℃滅菌20 min，冷卻待用。

液體種子培養基（g/L）：在無菌試管中裝入5 mL發酵培養基，在115-121℃滅菌20 min，冷卻待用。

無金屬離子培養基：蔗糖1.5%：酵母膏0.1%；蛋白胨0.5%：去離子水100 mL；自然pH；在115-121℃滅菌20 min，冷卻待用。

1.1.3儀器 不銹鋼手提式蒸汽滅菌鍋，上海博訊儀器廠；雙層小容量全溫度恒溫震蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；722 s分光光度計，上海精密儀器科學有限公司；TGL-16C型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；MJP-150型霉菌培養箱、DK-S24型電熱恒溫水浴鍋；DGG-9070B型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1粗酶液的制備 從保藏的試管斜面挑取孢子于液體發酵培養基中，37℃振蕩培養72 h，取一定量發酵液，8 000 r/min離心15 min，其上清液即為粗酶液。

1.2.2酶活力測定方法 1 mL含殼聚糖0.5%（0.5g/100 mL）的乙酸緩沖液，加入1 mL粗酶液，37℃下保溫30 min，煮沸5 min終止酶反應。DNS法測定還原糖。相對酶活是以同組試驗的最高酶活性為1，其他酶活性與最高酶活的比值即為相對酶活。剩余酶活是經過一定處理后的酶活/原來的酶活。

1.2.3發酵培養的方法 在超凈工作臺內，從保存的試管斜面上挑取孢子，接入5 mL液體種子培養基中，27℃、150 r/min振蕩培養24h。再接入對應裝有45 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，27℃、150 r/min振蕩培養72 h。考察不同搖床轉速（0、50、100、150、180 r/min）、不同碳源（蔗糖、葡萄糖、氨基葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、D-甘露醇、粉末性殼聚糖、可溶性殼聚糖）及碳源濃度（0.50%、1.00%、1.50%、2.00%）、不同誘導性碳源（氨基葡萄糖、膠體殼聚糖、粉末殼聚糖）及碳源濃度（0.01%、0.30%、0.50%、0.70%、0.90%）對海洋真菌MF-08產殼聚糖酶的影響。

1.2.4酶學性質的研究方法

1）最適反應溫度及溫度穩定性：在不同溫度（30、35、40、45、50、55、60、70、80℃）下測定酶活，以確定最適反應溫度。將粗酶液分別置于不同溫度的恒溫水浴中保溫10 min，然后測定剩余酶活，以確定溫度對于酶穩定性的影響。

2）殼聚糖酶的熱溫度性：將粗酶液分別置于不同溫度（30、40、50、60℃）的恒溫水浴中保溫不同時間（0、10、20、30、40、50、60 min），然后測定剩余酶活，以確定殼聚糖酶的熱溫度性。

3）最適反應pH：采用不同pH（2.0、3.0、4.0、4.4、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、7.0、8.0）的乙酸-乙酸鈉緩沖液和0，5%殼聚糖底物溶液測定殼聚糖酶活，以確定其最適反應pH。

4）殼聚糖酶oH穩定性：將粗酶液與不同pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）的廣泛緩沖液以1：1的體積比混合，在4℃下放置6 h，測定剩余酶活，測定殼聚糖酶的pH穩定性。

5）金屬離子對殼聚糖酶活性的影響：分別向粗酶液中加入不同的金屬離子（Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺），4℃靜置10 min后，測定相對酶活。以不加金屬離子的酶液為對照，研究不同離子對殼聚糖酶相對酶活的影響。

2.結果與分析

2，1不同搖床轉速對海洋真菌MF-08產殼聚糖酶的影響

由圖1可見，隨著搖床轉速的增大，海洋真菌MF-08產出的殼聚糖酶相對酶活先升高后降低，當搖床轉速為150 r/min時，殼聚糖酶相對酶活最高，因此，選擇搖床的最佳轉速為150 r/min。

2.2不同碳源對海洋真菌MF-08產殼聚糖酶的影響

海洋真菌MF-08在濃度為1.0%的不同碳源條件下培養，經搖瓶振蕩培養72 h，測定殼聚糖酶相對酶活，結果如圖2所示。從圖2可知，在碳源濃度為1.0%時，蔗糖產殼聚糖酶的效果最好，因此選用蔗糖為碳源。

2.3不同碳源濃度對海洋真菌MF-08產殼聚糖酶的影響

在培養基中添加不同濃度的碳源，以判斷海洋真菌MF-08對不同碳源的利用情況，確定最佳的碳源及其濃度，試驗結果如圖3所示。由圖3可見，碳源濃度為1.5%的蔗糖產殼聚糖酶效果最好，因此選用濃度為1.5%的蔗糖作為碳源。

2.4不同誘導性碳源對海洋真菌MF-08產殼聚糖酶的影響

采用混合培養基來培養海洋真菌MF-08，在最佳碳源基礎上添加一定量的誘導性碳源，并記錄菌株的產酶情況，結果如圖4所示。由圖4可見，添加0.01%的氨基葡萄糖進行誘導，海洋真菌MF-08產出的殼聚糖酶相對酶活最高，故采用1.5%的蔗糖添加0.01%的氨基葡萄糖作為最佳碳源。

綜合以上試驗，海洋真菌FM-08的搖床培養最佳轉速為150 r/min，最佳碳源是1.5%的蔗糖基礎上添加0.01%的氨基葡萄糖。按照最佳條件進行發酵，經過優化后海洋真菌FM-08產出的殼聚糖酶相對酶活由初始酶活0.234 U/mL優化為1.769 U/mL，提高了7.56倍。

2.5殼聚糖酶酶學性質

2.5.1殼聚糖酶反應的最適溫度及溫度穩定性將殼聚糖酶酶促反應體系的溫度分別設定為不同的值，試驗結果如圖5所示。從圖5可以看出，反應溫度在40℃以下時，殼聚糖酶相對酶活隨著溫度的升高而增強，40℃時相對酶活最高，反應溫度高于40℃后，相對酶活隨之降低。所以，殼聚糖酶反應最適溫度為40℃。

殼聚糖酶在不同溫度下保溫10 min后，測得的剩余酶活如圖6所示。如圖6可知，溫度低于45℃，殼聚糖酶剩余酶活可保持在85%以上。

殼聚糖酶在30、40、50、60℃下放置不同時間后測定剩余酶活，結果如圖7所示。由圖7可知，在4個溫度下，30℃下放置的殼聚糖酶剩余酶活基本保持穩定，40℃下殼聚糖酶剩余酶活有所下降，50、60℃下殼聚糖酶很快失活。

2.5.2殼聚糖酶的最適反應pH 由圖8可以看出，隨著pH的增大，殼聚糖酶相對酶活先升高后降低，在pH為5.2時達到峰值，因此殼聚糖酶的最適合反應pH為5.2。

2.5.3 pH對殼聚糖酶穩定性的影響 從圖9可以看出，在4℃下放置6 h，不同pH下殼聚糖酶的剩余酶活隨pH的升高先升高后降低，在pH 4.0-6.0之間剩余酶活相對穩定。

2.5.4金屬離子對殼聚糖酶活性的影響 由圖10可以看出，Cu²⁺、Fe³⁺和Hg²⁺對殼聚糖酶相對酶活具有很明顯的抑制作用，尤其是Hg²⁺可以使殼聚糖酶完全失去活性。其他金屬離子對殼聚糖酶相對酶活影響差異不大。

3.小結

海洋真菌MF-08產殼聚糖酶的最佳碳源為1.5%的蔗糖添加0.01%的氨基葡萄糖誘導性碳源。最佳搖床轉速為150 r/min。在最優誘導條件下，海洋真菌MF-08產殼聚糖酶的酶活達到1.769 U/mL，相比優化前提高了7.56倍。海洋真菌MF-08部分酶學性質的研究表明，殼聚糖酶的最適作用溫度和最適反應pH分別為40℃和pH 5.2，酶活在pH4.0～6.0范圍內和40℃以下相對穩定：Cu²⁺、Fe³⁺和Hg²⁺對殼聚糖酶相對酶活具有明顯的抑制作用，尤其是Hg²⁺可以使殼聚糖酶完全失去活性。