洪山雞和麻城綠殼蛋雞禽內源性反轉錄病毒基因檢測與分析

李拓凡　梁雄燕　葉麗珣　萬亮　楊玉瑩

摘要：為了解禽內源性反轉錄病毒（AERs）在湖北地方雞種洪山雞和麻城綠殼蛋雞基因組中的存在狀況，利用禽內源性反轉錄病毒EAV、ev loci和ev/J特異性引物對兩種雞的基因組進行PCR檢測。結果表明。洪山雞和麻城綠殼蛋雞中均檢測出EAV、ev loci和ev/J三種禽內源性反轉錄病毒基因序列：核酸序列同源性分析顯示，洪山雞和麻城綠殼蛋雞基因組中的EAV、ev loci和ev/J之間的同源性分別為98.8%，99.6%和99.6%；進化樹分析顯示，兩種雞內的三種禽內源性反轉錄病毒均分別位于進化樹的同一分支，表明洪山雞和麻城綠殼蛋雞內源性反轉錄病毒具有共同的祖先并且進化路徑相似。洪山雞和麻城綠殼蛋雞的ev/J與ALV-J原型株HPRS-103同源性高于98%，且進化樹處于同一分支。而與ALV-J國內分離株SD9901、YZ9901毒株的同源性較低，并且進化樹位于不同分支，表明這兩種雞的ev/J可能與ALV-J原型株HPRS-103親緣關系更近，而與國內的外源性ALV-J分離毒株SD9901、YZ9901親緣關系較遠。

關鍵詞：禽內源性反轉錄病毒：ev loci：ev/J

禽內源性反轉錄病毒（Avian endogenous retrovirus，AERs）是一類存在于雞基因組中，隨宿主基因組遺傳復制的前病毒DNA序列。在外源性J亞群禽白血病病毒（ALV-J）出現以前，禽內源性反轉錄病毒一直未引起人們重視，直到發現ALV-J囊膜基因與雞基因組中內源性反轉錄病毒ev/J部分序列高度同源，人們才逐漸意識到禽內源性反轉錄病毒可能參與了外源性禽白血病病毒新亞群的形成，是外源性ALV-J形成的重要物質基礎。然而，禽內源性反轉錄病毒在中國地方雞種雞群中的存在狀況尚不清楚，本研究采用特異性引物對湖北省兩個地方品種雞群進行禽了內源性反轉錄病毒PCR檢測與分析，旨在了解這兩種雞種基因組中禽內源性反轉錄病毒的相關狀況，為進一步探索內源性禽反轉錄病毒與外源性病毒的傳播、進化、致病機理的相關性等提供一定的基礎數據和理論依據。

1.材料與方法

1.1主要材料與試劑

洪山雞、麻城綠殼蛋雞種蛋分別購自隨州市譚龍畜禽開發有限公司洪山雞保種場、麻城綠殼蛋雞原種保種場：M199細胞培養液和胎牛血清為Hyclone公司產品；PCR相關試劑和PMD19T-Vector購自寶生物工程（大連）有限公司：瓊脂糖凝膠回收試劑盒為北京鼎國昌盛公司產品：DM2000PlusDNA Marker為北京康為世紀生物公司產品：引物參照相關文獻及Genebank相關序列設計，均由上海捷瑞生物公司合成，各引物序列相關信息見表1。其中H5/H7，F2/R2，F5/R5為檢測引物，擴增片段不測序。

1.2模板DNA提取

分別取洪山雞（縮寫為HS）和麻城綠殼蛋雞（縮寫為ML）的10日齡雞胚進行原代雞胚成纖維細胞培養，待細胞長滿單層，取每個品種雞細胞各一瓶，分別收集細胞，用SDS法提取基因組DNA，用ALV-J特異性引物H5/H7進行PCR檢測，無外源性ALV-J感染的基因組DNA作為擴增禽內源性反轉錄病毒基因的DNA模板。

1.3PCR反應體系及條件

PCR均采用25μL反應體系：10xPCR Buffer2.5μL，Mg²⁺2μL，dNTP2 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，Ex Tag 0.25μL，加去離子水H₂O至25μL。PCR循環條件為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，退火30 s（不同引物對應的退火溫度見表1），72℃延伸1～2 min（延伸時間，按Taq酶效率1 kb/min計算），共33個循環：72℃10min，4℃10min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.4目的片段的克隆與測序

用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收PCR產物并與pMDTM19-T Vector連接，轉化DH5a感受態細胞，涂布氨芐青霉素平板，篩選陽性克隆菌，用M13通用引物對轉化菌進行進行PCR鑒定，送武漢擎科創新生物科技有限公司測序。

1.5序列分析

測序結果用核酸分析軟件DNAStar進行分析，所引用的相關基因序列均來自NCBI GenBank：EAV-0（X59844）；ev loci：Clonel（AY013303）；Clone3（AY013304）；Clone6（AY013305）；ev/J：EAV-HP （NC005947）；ALV-J：HPRS-103（Z46390），SD9901（AY897220），YZ9901（AY897222）。

2.結果與分析

2.1模板DNA提取及外源性ALV-J感染排除

以特異性引物H5/H7對所提取的洪山雞和麻城綠殼蛋雞DNA進行外源性ALV-J PCR擴增，電泳檢測顯示陽性對照擴增出ALV-J對應的片段，本試驗所提取的DNA未擴增出片段，如圖1所示。

2.2洪山雞和麻城綠殼蛋雞基因組內禽反轉錄病毒PCR檢測

分別以洪山雞和麻城綠殼蛋雞基因組DNA為模板，分別用禽反轉錄病毒EAV、ev loci、ev/J特異性引物進行PCR擴增，結果洪山雞和麻城綠殼蛋雞均檢測出與EAV、ev loci、ev/J對應的目標片段（圖2和圖3）。依據DNA模板及所使用的引物將從洪山雞基因組中擴增出的禽內源性病毒反轉錄片段依次命名為HS1、HS2、HS3、HS4、HS5、HS6；將從洪山雞基因組中擴增出的禽內源性病毒反轉錄片段依次命名為ML1、ML2、ML3、ML4、ML5、ML6。

2.3目的片段克隆與測序結果

將篩選的洪山雞和麻城綠殼蛋雞基因組內禽反轉錄病毒各片段陽性克隆菌送武漢擎科生物技術公司測序，得到HS1、HS3、HS4、HS6片段的大小分別為241、881、713、1 479 bp；MLl、ML3、ML4、ML6的大小分別為241、881、713、1 479 bp。

2.4EAV核酸序列分析

測序結果DNAStar分析顯示，洪山雞與麻城綠殼蛋雞的EAV中TM（跨膜糖蛋白單位）、LTR（長末端重復序列）基因之間區域的核酸序列（EAV-HS、EAV-ML）同源性為98.8%，而二者與EAV-0內源性序列的相應區域同源性分別為98.3%和99.6%：與E51內源性序列的同源性分別為74.7%和75.9%（圖4）。進化樹分析顯示，EAV-HS、EAV-ML與EAV-0處于同一分支而與E51處于不同的分支（圖5）。

2.5ev loci核酸序列分析結果

DNAStar分析顯示，洪山雞與麻城綠殼蛋雞基因組中ev loci的env基因之間的同源性為99.6%，而二者與原型株Clonel，Clone3，Clone6核酸同源性在98.6%-99.0%之間（圖6）。進化樹分析顯示eyHS、ev-ML處于同于分支，而與三個原型株處于不同的分支（圖7）。

2.5 ev/J核酸序列分析結果

洪山雞與麻城綠殼蛋雞中ev/J的env基因部分核酸序列之間同源性為99.6%，與EAV-HP相應區域的核酸同源性分別為98.5%、98.9%：與外源性ALV-J原型株HPRS-103及SD9901、YZ9901分離株的同源性為95.5%-98.1%（圖8）。進化樹分析顯示，ev/J-HS、ev/J-ML與ALV-J原型株HPRS-103處于進化樹同一分支，而與外源性ALV-J的SD9901、YZ9901處于不同分支（圖9）。

3.討論

禽內源性反轉錄病毒（Avian Endogenous Retrovirus，AERs）是一類存在于雞基因組中，隨宿主基因組遺傳復制的前病毒DNA序列，是外源性禽白血病病毒早期感染留下的“內影像”。在外源性J亞群禽白血病病毒（ALV-J）出現以前，禽內源性反轉錄病毒一直未引起人們重視，直到發現ALV-J的env基因與禽內源性反轉錄病毒ev/J（EAV-HP）的eny序列具有高達96%的同源性后，人們才逐漸意識到禽內源性反轉錄病毒的重要性。當前的研究結果表明，外源性的ALV-J可能是內源性ev/J與其他外源性ALV發生重組產生的新的亞群，禽內源性反轉錄病毒可能是外源性禽白血病新亞群形成的重要物質基礎。

本研究利用特異性PCR引物對湖北省地方品種洪山雞和麻城綠殼蛋雞基因組進行了部分禽內源性反轉錄病毒檢測。結果表明，2個品種的雞基因組中均檢測到ev loci、ev/J、EAV 3種禽內源性反轉錄病毒。核酸序列同源性分析顯示這兩種雞中的禽內源性反轉錄病毒EAV、ev loci座、ev/J均具有高度同源性，分別為98.8%、99.6%、98.5%；進化樹分析顯示，在相應的病毒進化樹中兩種雞的3種禽內源性反轉錄病毒均分別處于同一分支。這可能提示，洪山雞和麻城綠殼蛋雞內源性反轉錄病毒具有共同的祖先并且進化路徑相似。

另外，洪山雞和麻城綠殼蛋雞的ev/J與原型株HPRS-103同源性高于98%，且進化樹處于同一分支。而與國內SD9901、YZ9901毒株的同源性只有95%，并且進化樹也不處于同一分支，結果表明這2種雞以前所感染的外源性病毒與原型株HPRS-103關系密切，而與國內的一些分離毒株存在一定的差異。