接種物添加量對紫花苜蓿常溫厭氧發酵的影響

張莉娟　張無敵　尹芳　趙興玲　王昌梅　柳靜　楊紅　劉士清

摘要：以紫花苜蓿（Medicago sativa）為原料，分別加入30%、40%、50%的接種物，在常溫下（20～22℃）、總固體（TS）含量為6%（以30%接種量計算）的條件下進行厭氧發酵，考察接種量對紫花苜蓿發酵的日產氣量、pH、產氣速率的影響。結果表明，接種量為40%時的產氣效果良好，總產氣量為3 625 mL，比接種量為30%的試驗組高8.05%，略低于接種量為50%的試驗組。試驗初期，pH出現一定下降，但很快又恢復至合適水平，整個階段pH比較穩定。綜合考慮，對于紫花苜蓿發酵，40%的接種量較優。

關鍵詞：紫花苜蓿（Medicago sativa）；常溫厭氧發酵；接種物；接種量；產氣潛力

紫花苜蓿（Medicago sativa）簡稱苜蓿，是豆科苜蓿屬多年生草本植物，是世界上分布最廣的豆科牧草，也是中國種植面積最大的人工牧草，達到210萬hm²，在世界苜蓿生產大國中占第5位。紫花苜蓿作為品質優、產量高、適口性好的牧草飼料為全球畜牧業做出重大貢獻，并且長期種植苜蓿有改良土壤的作用，因此紫花苜蓿在中國生態建設中也有重要作用。隨著生物技術的快速發展，人們對紫花苜蓿的傳統利用從優質牧草擴展到其他方面，其中以苜蓿作為生物反應器來生產疫苗、工業酶制劑和工業可降解塑料以及一些重要的藥用蛋白等研究已經取得了很大進展。

前期探究了紫花苜蓿中溫條件下厭氧發酵的產氣潛力，為進一步實現紫花苜蓿資源化利用，提高其能源轉化效率，本研究欲摸索在實驗室水平上接種物濃度對紫花苜蓿反應啟動、產氣量及產氣速率的影響。通過選擇適宜的接種物濃度，以期達到啟動平穩、產氣速率快、產氣量多的效果，從而縮短反應周期，節省成本，增加經濟效益，為紫花苜蓿能源轉化效率提高提供理論依據。

1.材料與方法

1.1材料

發酵原料為紫花苜蓿，采自云南師范大學校園，經測定總固體（TS）含量為92.29%，揮發性固體（VS）含量為90.64%。接種物為實驗室發酵后的底泥，經測定TS含量為10.75%，VS含量為55.57%。

1.2試驗裝置

采用實驗室自制的500 mL的批量式發酵裝置，裝置示意圖如圖1所示。

1.3方法

1.3.1原料預處理 將紫花苜蓿清理后切碎成長度小于2 cm的小段，以便其與接種物充分混合均勻。

1.3.2試驗設計 設置A、B、C 3個不同接種量試驗組，其接種量分別為30%、40%、50%，每組分別設3個平行，發酵液TS按6%配制（以30%接種量計算）。為保證試驗的一致性，進行單瓶配料。具體配比見表1。為了提高試驗的精確度，設置3個空白組作為對照，在試驗結束后計算其總產氣量，并用各組的總產氣量減去相應值作為最終產氣量。采用常溫厭氧發酵，每天定時記錄溫度變化、產氣量、pH及火焰顏色。

1.3.3測試項目及方法 ①產氣量。采用排水集氣法測定，每天定時記錄各組的產氣量，以各組3個平行的平均產氣量作為各組的表征產氣量。同時采用火焰顏色比色卡法，根據火焰顏色來判斷氣體中的甲烷含量。②TS、VS含量。采用常規分析法測定原料接種物以及發酵前后料液的TS、VS。TS：在（105±5）℃的電熱恒溫干燥箱（202型）中烘干至恒重，利用TS計算公式求出TS；VS：在（550±20）℃箱形電阻爐（SX2-2.5-12型）中灼燒至恒重，利用VS計算公式求出VS。③pH。采用pH 6.4～8.0的精密pH試紙測定。

2.結果與分析

發酵溫度在20-22℃變化，統計了A、B、C 3個組日產氣量，對產氣速率進行計算，分別對發酵液前后的TS、VS、pH進行測定，最后分析接種物用量在紫花苜蓿發酵中的影響。

2.1接種量對紫花苜蓿發酵產氣量的影響

空白對照組厭氧發酵的產氣量極少，表明接種物中可被微生物利用的有機物很少，僅能起到一個提供生產者的作用，其自身產氣量對試驗的影響可忽略。發酵過程中A、B、C 3個組的日產氣量和產氣速率變化如圖2所示。由圖2可以看出，接種物濃度的不同對厭氧發酵產沼氣的影響很大。在試驗開始后，接種量最大的C組啟動速度最快，B組次之，A、B、C 3個組在整個試驗階段均出現了2個產氣高峰。其中，C組在發酵10 d時出現第1個產氣高峰，為360 mL，甲烷含量約為60%：B組和A組分別在15 d和20 d時出現了第1個產氣高峰，分別為320、300 mL，B組甲烷含量約為65%，A組約為55%。C組在19 d時出現第2個產氣高峰，為200mL；B組和A組的第2個產氣高峰分別在28 d和34 d，峰值分別為140、180 mL。

在厭氧發酵初期，反應器中尚未形成嚴格的厭氧環境，抑制了其產甲烷菌的活性。隨著反應器內氧氣的減少，產酸階段受到抑制，為產甲烷菌的生長繁殖創造良好的環境，產甲烷菌開始將產酸階段產生的有機酸轉化為CH4，產氣速率不斷加快。從整個發酵過程來看，在反應前半段，B組、C組產氣一直很好，很快達到產氣高峰，明顯高于A組；但在發酵23 d以后c組產氣量低于140 mL，產氣量明顯下降。可能是由于接種物濃度高，其中含有的產甲烷菌較多，有機物被產甲烷菌快速利用，產氣減少。張錫輝在Contois模型中提到，物料濃度一定時，若接種物濃度越大，接種物中微生物的生長速度將下降。經過一段時間的繁殖，產甲烷菌的數量進一步增加，產甲烷菌之間相互競爭造成相互抑制，導致產氣量下降，因此，c組的產氣量略高于B組。

整個過程中A、B、C 3個組的累積產氣量分別為3 355、3 625、3 685 mL，B組和C組的產氣量相差不大，但明顯大于A組，分別比A組多8.05%和9.84%。c組在27 d時產氣速率達80%以上，B組、A組分別在28 d和31 d時產氣速率才達到80%以上。在實際運用中，優先考慮B組、C組，這樣縮短水力滯留時間，節省成本。

2.2接種量對料液pH的影響

接種物濃度對反應物料液oH的影響如表2所示。在料液發酵前，料液pH分別為7.0、7.0、7.2，均在厭氧發酵的最適范圍內。厭氧發酵5 d時，A組的pH降到5.5，B、C組分別降至6.0、6.5，中間有5 d出現酸化現象。發酵8 d后，通過自身調節，pH不斷升高，并恢復至合適的pH范圍。8～20 d pH基本沒有發生變化，20 d時A、B、C組pH分別為6.7、7.0、7.0.20-30 d基本沒有變化，發酵后料液pH都是7.0，總體來講除了酸化期，pH的變化很小，在正常范圍內波動。

2.3接種量對TS、VS及原料產氣率的影響

不同濃度接種物的各試驗組，其原料產氣率、TS產氣率及VS產氣率如表3所示。由表3可以看出，C組的原料產氣率、TS產氣率及VS產氣率均高于A、B組，B、C組（B組為327 mL/g，C組為333mL/g）的TS產氣率明顯高于A組（302 mL/g），B、C兩個組之間差距較小。從火焰顏色來看，發酵過程中B組甲烷含量最高，并且發酵穩定。

3.結論

目前研究接種物主要集中在接種物的種類來源和濃度對厭氧發酵的影響。Suwannoppadd等采用發酵牛糞、消化污泥、草炭作為接種物對青草進行降解，并且比較快速高溫發酵啟動時的區別，結果表明消化污泥要比發酵牛糞、草炭效率高。潘云霞等研究不同接種物濃度對牛糞發酵反應啟動、產氣量及產氣速率的影響，接種物濃度6%、物料與接種物濃度為1：1情況下，結果表現最好。秸稈厭氧發酵需要對接種物種類、接種比進行研究，以此提高原料產氣率、甲烷含量，縮短發酵周期。

本研究結果表明，接種物是影響發酵的因素之一，而接種量同樣會影響發酵整體情況。適當的增大接種量能夠提高厭氧發酵的啟動速度，增強發酵體系的抗酸化緩沖能力：但當接種量過大時，由于產甲烷菌的相互競爭造成了相互抑制，原料產氣率會達到一定極限，并且所產氣體甲烷含量出現一定程度的降低。綜合各方面考慮，在紫花苜蓿厭氧發酵中，接種量以40%最佳，其TS產氣率為327 mL/g，VS產氣率為361 mL/g。