中藥四藤方對人胃癌BGC823細胞的侵襲力及上皮鈣黏附蛋白（E—cadherin）表達的影響

毛竹君 沈克平 姚瓊 鄭佳露 奚燕萍

摘要：目的 檢測中藥四藤方對人胃癌細胞株BGC823細胞上皮鈣黏附蛋白（E-cadherin）蛋白表達，并觀察中藥對胃癌細胞侵襲力的影響。方法 實驗組加入四藤方對細胞進行預處理，然后在進行培養。通過甲基噻唑基四唑法（MTT）檢測細胞活性，使用劃痕實驗檢測細胞侵襲能力變化，RT-PCR、檢測E-cadherin mRNA表達的變化。結果 四藤方能抑制人胃癌BGC823細胞的增殖；抑制缺胃癌細胞的侵襲力，并且能降低E-cadherin mRNA的表達。結論 四藤方可抑制人胃癌BGC823細胞的增殖，可能通過降低E-cadherin mRNA的表達來抑制人胃癌BGC823細胞侵襲力。

關鍵詞：中藥；胃癌；BGC-823；侵襲

四藤方由紅藤，野葡萄藤，藤梨根，菝葜四藥組成，來源于我院著名腫瘤專家邱佳信教授臨床驗方“胃腸安方”中的小拆方，我的導師沈克平主任認為此四味中藥補中有泄，抗胃癌同時不傷正氣，尤其適合胃癌患者。故導師治胃癌患者以此為基礎辯證與辨病相結合預防胃癌復發收效甚捷。前期研究證實四藤方具有一定抑制胃癌轉移的作用，本實驗進一步進行了四藤方在胃癌侵襲轉移方面的作用和機制的探索。

1 資料與方法

1.1實驗材料 ①中藥材四藤方（紅藤，野葡萄藤，藤梨根，菝葜）由龍華醫院藥材科提供，產地明確，經第二軍醫大學藥學院生藥學教研室鑒定。②主要試劑RPMI 1640培養基、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清（PAA公司產品）；甲基噻唑基四唑（MTT）（美國Sigma公司）；BGC-823細胞購于中科院上海細胞所，細胞培養皿等耗材為Conming公司產品；Trizol為Invitrogen公司產品；反轉錄試劑Reverse Transeriptase M-MLV、RNase Inhibitor、Oligo d（T）18、dNTP Mixture和RealTime PCR檢測試劑盒均為TaKaRa公司產品；

1.2主要儀器及設備細胞培養箱 日本（三洋；離心機、紫外分光光度計、熒光分光光度計和酶標儀，均鉤于美國Thermo公司；梯度PCR和RealtimePCR儀均為Ft本TaKaRa公司產品；倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司產品。

1.3方法

1.3.1四藤方藥物的提取 將四藤方飲片（菝葜、野葡萄藤、藤梨根等）浸泡30 min，煎煮2次，30min/次，紗布粗慮去渣，將所得濾液以5000 轉離心30min以初步去掉大的顆粒雜質。取清液濃縮至300ml，加等體積的無水乙醇后置于4℃ 冰箱過夜沉淀。取出各藥物與乙醇的混合液，再以5000轉，30min離心，取上清液旋轉蒸發回收乙醇濃縮藥液，濃縮至50ml左右時取出，室內揮發24h后冷凍干燥，當藥物成粉末狀時取出，稱重，臨用時用磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，0.22pure微孔濾器過濾除菌。

1.3.2實驗分組和干預 實驗時將細胞分為空白組、藥物干預組（組加人不同濃度四藤方（1、10、100、1000、10000μg/ml），其中空白組使用不含藥物的RPMI完全培養基培養，收集細胞樣本進行mRNA含量檢測，取處理后不同時間點細胞樣本進行細胞活性檢測。

1.3.3 BGC823細活性檢測將對數生長期的BGC823細胞使用胰酶消化，1000轉離心5min收集細胞沉淀，使用含10%FBS的RPMI 1640培養基調整細胞濃度至2.5×105個/ml每孔200ul。接種于96孔板，每組設5個平行孔，正常條件培養，于第24、48、72h，各取一塊培養板，每孔添加濃度為15 mg/ml的MTT，緩慢晃動培養板其在培養基均勻分布，正常條件共孵育4h，去培養液，加入DMSO150ul的溶液，于37℃溫育4h，100rpm震蕩10min。使用酶標儀檢測波長為570nm吸光值。

1.3.4 Realtime-PCR測定E-cadherin mRNA含量 各干預組BGC823細胞培養24h，收集細胞樣本，進行E-cadherin mRNA含量檢測。使用Trizol法提取細胞樣本的Total RNA，電泳判斷總RNA的完整性，紫外分光檢測RNA純度及濃度。使用M-MLV逆轉錄體系及Oligo（dT）18 Primer引物逆轉錄制備cDNA。設計用于定量檢測的PCR引物，引物序列如下：E-cadherin的上游引物序列為5'-GAACGCATTGCCACATAC-3'，下游引物序列為5'-ACCTTCCATGACAGACCC-3'。內參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），其上游引物序列為5'-GACAGTCAGCCGCATClTCT-3'，下游引物序列為5'-ACATGTAAACCATGTAGTTGAGGT-3'。PCR引物設計好之后，PCR驗證引物擴增效率和引物特異性，然后使用熒光染料法（SYBR）進行PCR反應。反應結束后，獲得實驗曲線和數據，進行數據分析。

1.3.5胃癌細胞BGC823侵襲力檢測使用劃痕實驗 使用含10%FBS的RPMI 1640培養基各組BGC-823細胞按5×105/L接種于6孔板中，細胞生長到80%～90%時，用200μl的槍頭沿著孔中央直徑線做劃痕，PBS洗1次，實驗組加入中藥四藤方（濃度為100μg/ml），為了排除增殖對遷移實驗的影響，每組設3個復孔。置培養箱中繼續培養24h后取出6孔板，分別在0h，24h倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合情況。比較各組細胞細胞向劃痕邊緣向劃痕內遷移的細胞數。

1.4統計學方法 采用方差分析（ANCOVA）及LSD兩兩比較法。應用SPSS15.0軟件進行方差分析及總體比較；P<0.05認為有統計學意義，P<0.01認為有極顯著性差異。

2 結果

2.1 BGC-823細胞增殖率檢測 通過MTT檢測可以發現，含不同藥物體積的培養液均能不同程度的抑制BGC細胞的生長與增殖，且培養液內藥物含量越高，培養時問越長，細胞生長受到的抑制作用也越明顯，見表1。不僅與對照組相比具有統計學差異（P<0.01），而且高濃度藥物組相比低濃度藥物組的抑制率，也有明顯統計學差異（P<0.01），見圖1。提示，中藥四藤方具有抑制BGC細胞生長增殖的作用。使用公式法求出四藤方提取物對于BGC823細胞的ID50：各藥物濃度組的生長抑制率（%）=（1-實驗孔平均OD值/對照孔平均OD值）×100% ，ID50=lg-1[Xm-i（∑P-0.5）]，重復 3次取平均值，取平均值約為 7.930%。

2.2 BGC-823細胞E-cadherin mRNA表達 通過Rt-PCR檢測可發現，四藤方ID50濃度干預的細胞，24h后E-cadherin mRNA的表達明顯高于對照組細胞（P<0.05）。提示，四藤方具有上調BGC細胞E-cadherin基因表達的作用（P<0.05），從而抑制腫瘤細胞的黏附轉移（表2，圖2）。

2.3細胞侵襲力實驗（劃痕實驗） 劃痕愈合實驗顯示，使用四藤方ID50濃度干預24h后，侵襲力較對照組組下降，明顯抑制人胃癌細胞株BGC-823的遷移，實驗組劃痕愈合率為（47.454～10.05）%，對照組劃痕愈合率為（88.23±5.45）%（P<0.05），見圖3及圖4。

3 討論

E-cadherin又被稱為上皮-鈣黏蛋白，定位于16號染色體長臂2區2帶，含有16個外顯子、15個內含子，全長約100 kb，其編碼的跨膜糖蛋白相對分子質量為124×103。E-cadherin廣泛分布于人類上皮細胞中，是鈣依賴的黏附分子家族成員之一，可介導正常細胞間的黏附，維持正常上皮細胞形態、極性及組織結構的完整性，同時還參與細胞內信號傳導[1～3]，當E-cadherin表達下降或缺失時，細胞間的相互黏附力下降，一旦獲得轉移的必要條件，就可脫離原發灶而發生侵襲和轉移[4]。因此，E-cadherin被認為是一種抑癌基因。

本實驗結果顯示中藥四藤方作用24h后可明顯抑制人胃癌細胞株BGC-823細胞的增殖。通過劃痕愈合實驗，我們發現中藥四藤方ID50濃度作用24h能明顯抑制人胃癌細胞株BGC-823的遷移。提示四藤方在降低胃癌的侵襲力方面可能具有一定抗腫瘤的作用。為了研究四藤方降低胃癌侵襲力的作用機制，我們檢測了ID50濃度的四藤方作用24h后BGC-823細胞 E-cadherin mRNA的表達量明顯提高。

四藤方由紅藤，野葡萄藤，藤梨根，菝葜四藥組成，大血藤，又名“大活血”、“紅藤”等，根據《中國藥典》記載，大血藤氣微，味苦微甘，性平，無毒，入肝、胃、心包、大腸經。具解毒消癰，活血止痛，祛風除濕，殺蟲功效。其中紅藤的粗提取液被發現具有很強的抗腫瘤活性[5]。野葡萄藤，《廣西植物名錄》：清熱利濕，消腫解毒。治痢疾，瘡瘍腫毒。有多項實驗研究發現其單獨具有抗胃癌功效是專病專藥[6]。藤梨根《全國中草藥匯編》清熱解毒，祛風除濕，利尿止血。用于風濕骨痛，以及黃疸等癥。有多項實驗研究發現其單獨具有抑制胃癌[7]的功效，屬于專病專藥。菝葜見《別錄》：“味甘，平溫，無毒。”《品匯精要》：“散腫毒。”紅藤、藤梨根清熱解毒，菝葜、野葡萄藤消腫祛濕。在前期實驗中我們發現示四藤方可以上調SGC -7901 胃癌Caspase -3 蛋白表達，促進PARP 蛋白剪輯，抑制Livin表達，從而促進細胞凋亡[8]。

本研究結果首次表明，中藥四藤方在體外可以有效抑制人胃癌BGC-823細胞株的增殖和遷移，其機制可能是通過促進BGC-823細胞E-cadherin mRNA表達，進而發揮了抑制胃癌細胞遷移的作用。

參考文獻：

[1]Hata H， Natsuga K， Kitamura S， et al.Concomitant neoplasms in skin and stomach unveil the role of type IV collagen and E-cadherin in MUC5AC expression in vivo[J].Br J Dermatol，2015，19.

[2]Jun KH， Lee JE， Kim SH， et al.Clinicopathological significance of N-cadherin and VEGF in advanced gastric cancer brain metastasis and the effects of metformin in preclinical models.[J].Oncol Rep，2015，34（4）：2047-2053.

[3]Caldeira J， Figueiredo J， Brás-Pereira C，et al.E-cadherin-defective gastric cancer cells depend on Laminin to survive and invade[J].Hum Mol Genet，2015，5. pii： ddv312.

[4].Hou X， Zhang Y， Qiao H.CCL18 promotes the invasion and migration of gastric cancer cells via ERK1/2/NF-κB signaling[J].pathway Tumour Biol，2015.

[5] 復方紅藤顆粒配合化療治療惡性腫瘤30例臨床研究。吳繼萍、貝立民、松民武.中醫藥臨床雜志.2004，16（4）： 314-316頁，

[6] 何萍、沈克平、胡兵、梁云麒.四藤方對人胃癌SGC-7901細胞增殖及凋亡的影響。時珍國醫國藥.2015，26（3）： 531-533頁

[7] 郭潔、王小平、白吉慶，藤梨根提取物對人胃癌BGC細胞凋亡及Bax蛋白表達的影響.亞太傳統醫藥.2014，10（13）： 12-13頁.

[8] 何萍，沈克平，胡兵，盧艷琳.四藤方對SGC -7901 胃癌Caspase -3、剪輯型PARP 及Livin 表達影響.中華中醫藥學刊.2014，32（2）：247-249

編輯/安樺