探討EGF基因多態性與食管癌淋巴結轉移風險的相關性

孫濤 陸靜 顧海勇 尹俊 唐巍峰 陳鎖成

摘要：目的 研究表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）單核苷酸多態性與中國漢族人群食管癌患者淋巴結轉移風險的關系。方法 采用SNPscanTM高通量基因分型技術，分析380例食管癌患者淋巴結轉移組（n=85）和無淋巴結轉移組（n=270）EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A兩位點各基因型頻率，并計算各基因型的食管癌淋巴結轉移風險及其95%可信區間。結果 EGF rs3756261 T>C基因型分布頻率在食管癌淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組之間沒有顯著差異（P=0.657）。在多因素Logistic回歸分析中，在調整了年齡、性別、吸煙及飲酒狀況后，沒有發現EGF rs3756261 CC基因型與食管癌淋巴結轉移風險存在相關性（調整OR=1.10，95%CI=0.34-3.56，P=0.88）。在隱性模型中，調整了年齡，性別，吸煙及飲酒狀況后，沒有發現CC基因型的個體淋巴結轉移風險發生明顯改變（調整OR=0.99，95%CI=0.31-3.14，P=0.98）。對EGF rs11568835 G>A多態性位點進行相同的單基因位點及logistic回歸分析，沒有發現其基因型分布頻率在組間存在差異，結果也未顯示其突變基因型與食管癌淋巴結轉移易感性存在統計學意義的關聯。結論 EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A基因多態性與食管癌淋巴結轉移易感性之間無相關性。

關鍵詞：食管癌；淋巴結轉移；表皮生長因子；單核苷酸多態性

高淋巴結轉移率是食管癌的特征之一[1]。Tachikawa等人[2]研究指出淋巴結轉移模式能反映食管癌進展程度且是影響患者總體生存期的決定性因素，因此可以作為判斷患者預后的重要標志并指導個體化治療。目前的檢查技術很難發現小的淋巴結轉移灶，術前檢查未發現有淋巴結轉移的食管癌患者中，超過40%的患者術后病理發現局部淋巴結轉移為陽性[3]。因此我們需要一種新穎并且精確的方法來評估預測淋巴結轉移情況。

表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）是一種重要的細胞分裂劑，可促進細胞增殖、分化、惡性轉化和轉移[4]，但正常生理水平量的EGF并不會導致消化道腫瘤的發生。人體EGF基礎分泌水平部分取決于遺傳因素，其基因的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）可引起EGF表達量的改變[5]，最終可能改變機體某些惡性腫瘤的易感性。已有文獻報道EGF的過表達在促進食管癌局部浸潤和遠處轉移的過程中扮演了重要的角色[6]。在EGF基因5'端非編碼區（5'-UTR）存在三個SNP位點：EGF rs444490A>G，EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A。目前對于EGF rs444490A>G的研究已較多較深入，但關于EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A的研究還比較少。因此，在本次實驗中，我們研究了EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A基因多態性與食管癌淋巴結轉移易感性之間是否存在關聯。

1 資料與方法

1.1一般資料 病例是自2008年10月～2009年11月從江蘇大學附屬人民醫院胸外科、江蘇大學附屬醫院胸外科收集的380例食管癌患者，均由纖維胃鏡及胃鏡病理診斷，且術后病理均確診為鱗狀細胞癌。淋巴結轉移情況由術中取淋巴結進行病理檢查確定。其中有完整淋巴結轉移信息的食管癌病例為355例，85例有淋巴結轉移，270例無淋巴結轉移。所有患者均來自江蘇省鎮江市及周邊地區，為漢族人群。

1.2流行病學調查 對患者使用統一設計的生活狀況與健康調查表進行調查，調查內容包括：一般情況、吸煙史、飲酒史、身體狀況及疾病史、職業史和家族史、胃鏡及手術標本病理以及食管癌淋巴結轉移情況等。調查員分別為鎮江市第一人民醫院工作人員和江蘇大學臨床醫學院外科學專業的研究生，經培訓后使用統一調查表對研究對象進行逐一訪問調查。

1.3實驗方法 在獲得書面的知情同意書后，空腹采集2mL EDTA抗凝血，1h內用4000r/min離心10min，分離白細胞層，采用Qiagen DNA提取試劑盒提取DNA。基因分型采用上海天昊生物技術有限公司自主專利開發的2x48位SNPscanTM高通量SNP分型技術。基于5'端及3'端雙側探針連接反應及多重熒光PCR擴增、電泳分離從而獲取各SNP位點的基因型（見圖1）。實驗條件根據制造商說明書來設定。首先，將100-200ng DNA樣本置于10μl含有1xDNA裂解緩沖液的反應體系中98℃，5min變性裂解，然后將其與10μl含有2μl 10x連接酶緩沖液、0.5μl連接酶、1μl混合探針以及7.5μl Mili-Q水的連接預混液充分混合。連接反應在ABI 2720熱循環儀內完成，采用以下反應條件：4個循環（94℃1min，58℃4hr），94℃2min，溫度控制在4℃并且立即加入20μl 2x終止緩沖液停止反應體系。每一個連接產物都采用2x48位熒光PCR反應擴增。PCR反應體系為20μl混合液，其中包括了1xPCR預混液，1μlPCR引物和1μl連接產物。PCR反應體系為：95℃2min；94℃20s 9個循環，65℃-0.5℃/40s循環，72℃1.5min；94℃20s 25個循環，57℃40s，72℃1.5min；60℃1hr；最后恒溫在4℃。PCR產物分離和檢測由毛細管電泳法在ABI3730XL測序儀上檢測，原始數據分析和基因型判別由GeneMapper4.0完成。

1.4統計學方法 用SPSS13.0統計軟件包進行統計學處理。食管癌淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組基本特征比較采用χ2檢驗或/和t檢驗。單因素和多因素Logistic回歸分析計算優勢比（odds ratio，OR）及其95%可信區間（Confidence Interval，CI）表示EGF rs444490A>G，EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A基因多態性與食管癌淋巴結轉移易感性的關系。

2 結果

2.1食管癌淋巴結轉移組及無淋巴結轉移組的基本信息比較（表1）：380例食管癌患者中中355例（93.4%）有完整淋巴結轉移信息。術后病理證實有局部淋巴結轉移的患者為85例（23.9%），270例（76.1%）患者無淋巴結轉移。淋巴結轉移組平均年齡（61.85±7.07）歲，72.9%為男性，無淋巴結轉移組平均年齡為（63.21±8.76）歲，69.3%為男性，結果提示兩組年齡與性別匹配良好，P值分別為0.147和0.518。吸煙及飲酒狀況在淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組之間無明顯差異，P值分別為0.307和0.599。

2.2EGF基因多態性和食管癌淋巴結轉移易感性的關系（表2）：EGF rs3756261 T>C三種基因型TT、TC、CC在食管癌淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組的頻率分布分別為57.8%，37.3%，4.8%和63.1%，31.9%，5.0%，兩組基因型分布頻率未發現有明顯差異（P=0.657）。在多因素Logistic回歸分析中，以EGF rs3756261 TT基因型作為參照，在調整了年齡、性別、吸煙及飲酒狀況后，沒有發現EGF rs3756261 TC基因型（調整OR=1.34，95%CI=0.79-2.28，P=0.28）和CC基因型（調整OR=1.10，95%CI=0.34-3.56，P=0.88）與食管癌淋巴結轉移風險存在相關性。在隱性模型中，相對于TT+TC基因型而言，EGF rs3756261 CC基因型與食管癌淋巴結轉移易感性無統計學意義的相關性（OR=0.96，95%CI=0.31-3.04，P=0.95）；隱性模型中調整了年齡，性別，吸煙及飲酒狀況后，以EGF rs3756261 TT+TC基因型作為參照，CC基因型的個體淋巴結轉移風險無明顯改變（調整OR=0.99，95%CI=0.31-3.14，P=0.98）。對EGF rs11568835 G>A多態性位點進行相同的單基因位點及logistic回歸分析，沒有發現其基因型分布頻率在組間存在差異，結果也未顯示其突變基因型與食管癌淋巴結轉移易感性存在統計學意義的關聯。

3 討論

轉移是導致癌癥患者死亡的根本原因[7]，大約50%～60%的食管鱗癌患者死于淋巴結轉移和/或遠處轉移[8-9]。目前常用的CT、EUS和PET-CT等檢查對于診斷較小的淋巴結轉移灶準確性較低，經常出現假陰性結果，因此我們需要從分子水平深入的了解食管癌淋巴結轉移機制，以期能盡早準確的對患者淋巴結轉移作出診斷，評估患者預后并制定合理的個體化治療方案。

Motoyama等人[3]指出食管鱗癌淋巴結轉移模式可能和遺傳因素有關。他們在研究中發現C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）SNP位點CRP 1846C>T基因多態性可能作為一個獨立因素影響著食管鱗癌患者淋巴結轉移的易感性。EGF是食管癌惡性進展的一個促進因子[10]。綜上，我們在實驗中選擇了EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A這兩個基因多態性位點作為研究靶點，探討了兩者基因多態性與食管癌淋巴結轉移風險之間的相關性。

我們的實驗尚存在以下不足：①并未對組間EGF表達水平進行比較，基因多態性是否會引起EGF表達水平的改變以及食管癌淋巴結易感性與EGF的異常表達是否存在直接關聯，在我們的實驗中都缺乏相關數據說明，因此還需對基因多態性和蛋白進行進一步的功能學研究；②沒有進行單倍型分析：因為單基因位點并不能完全代表該基因啟動子區的功能，單倍型分析對個體易感性有更準確的評價；③研究結果為陰性可能是由于樣本量有限、統計學效能較低引起，因此我們還需對多態性位點進行多中心的大樣本研究。

綜上，EGF rs3756261 T>C和EGF rs11568835 G>A基因多態性與食管癌淋巴結轉移易感性之間無相關性，我們還需進行進一步的功能學研究以及大樣本前瞻性研究。

參考文獻：

[1]Chen J，Pan J，Zheng X，et al.Number and location of positive nodes，postoperative radiotherapy，and survival after esophagectomy with three-field lymph node dissection for thoracic esophageal squamous cell carci-noma[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，2012，82：475-482.

[2]Müller JM，Erasmi H，Stelzner M，Zieren U，Pichlmaier H.Surgical ther-apy of oesophageal carcinoma[J].Br J Surg，1990，77：845-857.

[3]Motoyama S，Mori K，Kamei T，et al.Evaluation of the Risk of Lymph Node Metastasis Using CRP 1846C>T Genetic Polymorphism in Submucosal Thoracic Esophageal Squamous Cell Carcinoma[J].Ann Surgical Oncology，2012.

[4]Cai Z，Wang Q，Zhou Y，et al.Epidermal growth factor-induced epithelial-mesenchymal transition in human esophageal carcinoma cells-A model for the study of metastasis[J].Cancer Letters，2010，（296）：88-95.

[5]Zhu J，Meng X，Yan F，et al.A functional epidermal growth factor（EGF）polymorphism，EGF serum levels and renal cell carcinoma risk in a Chinese population[J].J Hum.Genet，2010，55：236-224.

[6]Yoshida K，Kuniyasu H，Yasui W，et al.Expression of growth factors and their receptors in human esophageal carcinomas：regulation of expression by epidermal growth factor and transforming growth factorα[J]. Cancer Res Clin Oncol，1993，119：401-407.

[7]D.Hanahan，R.A.Weinberg.The hallmarks of cancer[J].Cell，2000，100：57-70.

[8]G.P.Stathopoulos，N.Tsiaras.Epidemiology and pathogenesis of esophageal cancer：management and its controversial results[J].Oncol.Rep，2003，10：449-454.

[9]G.D.Stoner，A.Gupta.Etiology and chemoprevention of esophageal squamous cell carcinoma[J].Carcinogenesis，2001，22：1737-1746.

[10]di Pietro M.，Fitzgerald R.C.Barrett's oesophagus：an ideal model to study cancer genetics[J].Hum.Genet，2009，126：233-246.

編輯/周蕓霏