胚胎培養液氨基酸濃度與拉曼光譜特征對IVF—ET妊娠結局的影響研究

譚小方 金華 徐麗 施蔚虹 李海波 丁家怡

摘要：目的 探討胚胎培養液氨基酸濃度與拉曼光譜特征對IVF-ET妊娠結局的影響表現。方法 選取163對行IVF-ET助孕的夫婦，按照是否妊娠分為移植妊娠組和移植未妊娠組，收集胚胎培養液檢測氨基酸代謝水平，行拉曼光譜分析。結果 移植妊娠組天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸水平均低于移植未妊娠組，丙氨酸-谷氨酰胺水平高于后者（P<0.05）；移植妊娠組胚胎培養液拉曼光譜信號與移植未妊娠組相比明顯增強（P<0.05）。結論 天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、丙氨酸-谷氨酰胺水平和拉曼光譜特征對胚胎移植后的妊娠結局有一定的影響。

關鍵詞：胚胎培養液；氨基酸濃度；拉曼光譜特征；IVF-ET妊娠結局；影響

隨著氨基酸代謝及光譜技術研究的不斷深入，人們逐漸發現氨基酸代謝水平、拉曼光譜與胚胎發育潛能之間有一定的關聯，可以作為檢測胚胎質量的輔助方法[1]。本文探討了胚胎培養液氨基酸濃度與拉曼光譜特征對IVF-ET妊娠結局的具體影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 資料來源于2013年于南通婦幼保健院生殖醫學中心行IVF-ET助孕的163對不孕夫婦的臨床資料，在患者知情同意的原則和醫院生殖醫學倫理委員審議批準下，符合以下條件：①女方年齡≤35歲；②夫妻雙方無確診的染色體異常；③非反復種植失敗者（既往連續種植失敗的周期數﹤3）；④女方無宮腔鏡確診的宮腔畸形、粘膜下子宮肌瘤或子宮內膜息肉；⑤女方無腹腔鏡或B超診斷的子宮內膜異位癥或子宮腺肌病；⑥女方無確診的多囊卵巢綜合征（PCOS）；⑦促排卵過程中B超下未見明顯的輸卵管積液或宮腔積液；⑧人絨毛膜促性腺激素（HCG）注射日內膜厚度≥8mm，B超下內膜無明顯異?；芈暪鈭F。按照移植胚胎是否妊娠分為移植妊娠組和移植未妊娠組，移植妊娠組81例，年齡25～34歲，移植未妊娠組82例，年齡24～35歲。

1.2方法

1.2.1胚胎培養 ①收集胚胎培養液：收集不同卵裂階段的胚胎培養液，以其體外培養的胚胎及培養液為研究對象，結合胚胎形態學評分系統，原核期評分采用Scott評分法，卵裂期胚胎評分及分級采用Gardner評分法。分別收集原核期、二細胞期、四細胞期、八細胞期、囊胚期胚胎培養液；②保存胚胎培養液：在經形態學評估后，移出胚胎后，收集原核期、二細胞期、四細胞期、八細胞期、囊胚期胚胎培養液，于-80℃冰箱保存，待測。

1.2.2氨基酸成分分析 取胚胎培養液10μL，用流動相10倍稀釋，用HPLC法分析20種游離氨基酸濃度。HPLC條件：C18反相色譜柱，4.0×125mm，粒徑5μm；流動相A：10mmol/L Na2HPO4+pH 7.2 PBS緩沖液，流動相：PBS+甲醇+乙腈（體積比50：35：15）；梯度洗脫：在0～20min內，流動相B以線性從0上升至100%；流速1.0ml/min；株溫：40℃；激發波長340nm，檢測波長450nm。

1.2.3拉曼光譜分析 冷凍的胚胎培養液室溫解凍后放置30 min以使標本恒溫，毛細管吸取5μL標本，置于拉曼顯微鏡下進行拉曼光譜分析。實驗條件：激發光：氬離子激光器，激發波長514.5nm，激光輸出功率20mW，CCD檢測器，曝光時間20～60s，測量范圍：50～4000cm-1。

1.3統計學方法 采用SPSS軟件包進行統計學分析。數據描述采用（x±s），兩組定量資料比較采用t檢驗或秩和檢驗；單因素和多因素Logistic回歸分析氨基酸濃度與IVF妊娠結果的關系；P<0.05為差異有統計學意義。根據臨床隨訪妊娠結局，分析妊娠組和非妊娠組不同階段胚胎培養液的光譜，及各胚胎期培養液氨基酸濃度分析，篩選出與妊娠相關的代謝成分指標。

2 結果

2.1移植妊娠組和移植未妊娠組胚胎培養液中氨基酸水平對比 對比移植妊娠組和移植未妊娠組的10種氨基酸水平發現，移植妊娠組中天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸水平均低于移植未妊娠組，而且丙氨酸-谷氨酰胺水平高于后者，P<0.05，有統計學意義。見表1。

2.2氨基酸水平對IVF-ET妊娠結局影響的回歸分析結果

Logistic回歸分析顯示IVF-ET妊娠結局與谷氨酰胺、丙氨酸、丙氨酸-谷氨酰胺呈負相關。見表2。

2.3移植妊娠組和移植未妊娠組胚胎培養液拉曼光譜對比 移植妊娠組胚胎培養液拉曼光譜信號與移植未妊娠組相比明顯增強，P<0.05，有統計學意義。見圖1。

3 討論

IVF-ET自世界上首例試管嬰兒誕生以來便引起了全社會的廣泛關注，人類整體妊娠率也有所提高，但是IVF-ET妊娠成功率仍然不足30%，嚴重影響IVF-ET技術的臨床推廣[2]。研究發現，影響IVF-ET妊娠結局的因素是多方面的，雖然多個胚胎移植能夠顯著提高妊娠成功率，但是其所導致的產科并發癥也較多[3]。

本次研究結果顯示天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、丙氨酸-谷氨酰胺水平和拉曼光譜特征對妊娠結局都有一定的影響?？梢姡鲜霭被岽x水平在一定程度上反映了胚胎的發育潛能，而且分析胚胎培養液的拉曼信號強度有助于提升胚胎質量評估的準確性。

參考文獻：

[1]鄧彬，李予，王文軍，等.胚胎培養液氨基酸濃度與體外受精-胚胎移植妊娠結局的關系[J].中山大學學報（醫學科學版），2013，34（6）：900.

[2]易艷紅，董梅，陳創奇，等.胚胎培養液中氨基酸濃度對選擇性單胚胎移植妊娠結局的影響[J].中華實用診斷與治療雜志，2014，28（12）：1163-1165.

[3]譚小方，金華，徐麗，等.IVF-ET周期中胚胎培養基的氨基酸代謝水平與妊娠結局的相關性研究[J].生殖醫學雜志，2015，24（3）：186-190.

編輯/周蕓霏