HE4在子宮內膜異位癥中的表達及意義

任俊英 王維琴 王艷婷 皇甫昱

[摘要] 目的 通過檢測HE4在異位子宮內膜、正常子宮內膜中的表達，以進一步分析HE4在子宮內膜異位癥的發生發展，以及良性疾病惡性表現中所起的作用。方法 選擇內蒙古自治區人民醫院2012年7月—2014年7月收治的90例，通過病理確診的子宮內膜異位癥60例，正常內膜組織的因子宮病變而進行子宮全切術的患者30例。采用免疫組化實驗方法對兩組石蠟切片進行化學染色，并進行對染色結果的染色強度進行評價，同時應用mIgae-or-plus對染色切片中的陽性部分測量其平均灰度值（mean IOD），并分析HE4在子宮內膜異位癥中的表達情況。結果 ①HE4主要在子宮內膜腺上皮細胞中表達，而間質中僅有少量表達，且腺體中的表達明顯高于間質（P=0.000 <0.05）。異位內膜組與正常內膜組比較，腺上皮中的表達異位內膜組高于正常內膜組（χ2=7.200 0，P=0.007 <0.05）。②子宮內膜異位癥中異位內膜在r-AFS分期中Ⅰ～Ⅱ期的HE4表達強度低于異位內膜組Ⅲ～Ⅳ期，兩者比較有統計學意義（t=11.117，P=0.000 <0.05）。③異位內膜組織在月經周期的增生期HE4陽性表達高于分泌期HE4的表達，差異有統計學意義（t=10.496，P=0.000 <0.05）。正常內膜組織在月經周期的增生期HE4陽性表達高于分泌期HE4的表達，差異有統計學意義（t=7.483，P=0.000 <0.05）。結論 HE4在子宮內膜異位癥異位內膜的表達增強，從r-AFS分期，I期至IV期，異位內膜組織中含量呈上升趨勢，說明HE4可能參與了子宮內膜異位癥的發生和疾病的發展。

[關鍵詞] HE4；子宮內膜異位癥；免疫組化

[中圖分類號] R737.31 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2016）03（c）-0033-04

Expression of HE4 in the Endometriosis and Its Significance

REN Jun-ying1， WANG Wei-qin2， WANG Yan-ting1， HUANGFU Yu3

1. Department of Obstetrics and Gynecology， Hohhot First Hospital， Hohhot， Inner Mongolia Autonomous Region， 010030 China；2. Department of Obstetrics and Gynecology， Inner Mongolia Peoples Hospital， Hohhot， Inner Mongolia Autonomous Region， 010010 China；3. Department of Personnel， Hohhot Municipal Health Bureau， Hohhot， Inner Mongolia Autonomous Region， 010010 China

[Abstract] Objective To detect the expression of HE4 in endometriosis and normal endometrium， in order to further explore the generation and development of HE4 in endometriosis and its effect in benign disease with malignant manifestations. Methods In this study， the 90 tissue specimens are from the Department of Pathology， Inner Mongolia Peoples Hospital， from July 2012 to July 2014. Totally 60 endometriosis samples were investigated as the experimental group， and 30 normal endometrium tissue samples from 30 cases underwent hysterectomy due to uterine lesions were set as the negative control group. The expression of HE4 was examined by immunohistochemical staining between experimental group and control group. And the expression intensity of HE4 was estimated by the microscope. The mean IOD of positive expression rates of HE4 was determined by mIgae-or-plus. The expression of HE4 in the endometriosis was analyzed. Results ①HE4 mainly expressed in endometrial glandular epithelial cells， it only expressed a little in mesenchyme. The expression of HE4 in the glandular tissue was much more than that in the mesenchyme（P=0.000）. The expression of HE4 in the glandular epithelium in the ectopic group was higher than that in the normal endometrium group（χ2=7.200 0， P=0.007<0.05）. ② The expression of HE4 in ectopic endometrium r-AFS stage Ⅲ～Ⅳ was higher than that in stageⅠ～Ⅱin endometriosis（t=11.117， P=0.000）. ③ The expression of HE4 in proliferative phase of menstrual cycle was higher than that in secretory phase in the ectopic endometrium（t=10.496， P=0.000<0.05）. The expression of HE4 in proliferative phase of menstrual cycle was higher than that in secretory phase in the normal endometrinm（t=7.483， P=0.000<0.05）. Conclusion The expression of HE4 in ectopic endometrium in endometriosis is significantly higher than that in normal endometrium. With the stage increasing from r-AFS stage I to IV， the expression of HE4 shows a rising trend， which indicates that HE4 may participate in the occurrence and development of endometriosis.

[Key words] HE4； Endometriosis； Immunohistochemistry

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMs）是婦女的常見病、多發病，好發于生育期婦女，該病的發病率近年來逐漸增加。臨床表現為下腹痛和痛經、月經異常、不孕等[1]。EMs是一種良性疾病，表現的細胞增生、侵潤、復發等惡性生物學行為，以及有組織學惡變傾向，使之成為婦產科醫生的困擾。盡管先進的研究日漸深入，但對其確切的發病機制仍然不明，治療上也就不滿意，成為婦產科臨床與基礎研究的焦點和難點[2]。隨著國內外研究者對新發現的人附睪分泌蛋白因子4（human epididymis protein 4，HE4） 的不斷深入研究，發現HE4在子宮內膜異位癥中也發揮著重要作用[3]。因此，該研究對2012年7月—2014年7月就診于內蒙古自治區人民醫院的90例患者，根據術后病理確診為異位子宮內膜60例、正常內膜30例進行免疫組化檢測HE4的表達結果，進一步探討HE4與子宮內膜異位癥的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象選擇內蒙古自治區人民醫院90例手術患者的石蠟標本，通過病理確診其中子宮內膜異位癥的石蠟標本60例，患者年齡31～52歲，平均年齡35歲。對60例異位內膜組織蠟塊進行r-AFS分期中Ⅰ期8例、Ⅱ期18例、Ⅲ期24例、Ⅳ期10例。正常內膜組織的因子宮病變而進行子宮全切術的患者30例年齡41～56歲，平均年齡46歲。

實驗組：異位內膜組織蠟塊60例。對照組：正常內膜組織30例。

1.2 試劑及方法

一抗：即用型兔抗人HE4多克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司，規格100 ug濃縮液。批號14406-1AP；保存開封后4 ℃保存。二抗：即用型SABC免疫組化染色試劑盒規格：12 mL 4℃保存，避免冷凍DAB試劑盒：以上試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司3%過氧化氫：購于福州邁新生物公司自備試劑 購于福州邁新生物公司：免疫組化專用PBS液（pH7.2～7.6）配法：1 000 mL蒸餾水中加氯化鈉8.5 g，Na2HPO4 2.8 g，NaH2PO4 0.4 g；0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液：1 000 mL蒸餾水中加枸櫞酸三鈉（C6H5Na3O4·2H2O）3 g，枸櫞酸（C6H8O7·H2O）0.4 g；中性樹膠。

1.3 試驗方法

免疫組化染色：標本石蠟塊，制作成4 μm石蠟切片，烤片，脫蠟，水化，滴加3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）熱修復抗原，5%BSA封閉液滴加于每張切片，每張切片滴加第一抗體兔抗人多克隆抗體HE4，4 ℃冰箱過夜，PBS液洗片，每張切片加試劑山羊抗兔IgG，20～37 ℃溫箱下卵育20 min，PBS沖洗，每張切片滴加SABC，室溫下孵育15 min，DAB顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，封片，然后在顯微鏡下閱片并照相。

1.3.1 觀察標準 病理科由2名醫生用雙盲法分別進行閱片監測。綜合染色強度和陽性細胞百分率分布按照SHIMIZU等方法確定HE4在組織中的表達水平。①染色強度，染色不清楚（和）或無染色為0分；染色強于陰性顯示為弱黃色為1分；染色清晰棕黃色為2分；染色強為深棕色（和）或褐色為3分。②陽性細胞百分率：陽性細胞數<10%為0分；11%～25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。每張切片計分等于以上兩項分數的乘積；0～1分為（-）；2～3分為弱陽性（+）；4～5分為中度陽性（++）；﹥5分為強陽性（+++）。

1.3.2 平均灰度值測量 mIgae-or-plus5.0專業圖像分析系統下，測量每張切片的陽性細胞的平均灰度值（meanIOD）并將數據進行統計學分析。

1.4 統計方法

描述性資料以表示，兩獨立樣本均數比較用t檢驗；多個樣本均數比較，經檢驗方差不齊，采用多個獨立樣本比較的秩和檢驗；異位子宮內膜r-AFS分期Ⅲ～Ⅳ與Ⅰ～Ⅱ期meanIOD值比較，因檢驗方差不齊，采用兩獨立樣本比較的t檢驗，檢驗水準取α=0.05。計數資料組間兩兩比較采用行×列資料分割的χ2檢驗，經校正α'=0.008；所得數據均應用SPSS 17.0統計軟件進行統計處理分析。

2 結果

2.1 根據測得的平均灰度值分析HE4在子宮異位內膜、正常內膜組織中的表達情況

異位內膜組織中HE4顆粒定位于子宮內膜腺上皮細胞胞膜及細胞漿中呈棕黃色陽性顆粒，部分間質可見陽性表達，其表達的meanIOD值為0.580 1±0.011 5。正常內膜組織中HE4顆粒定位于子宮內膜腺上皮細胞胞膜及細胞漿中呈淡黃色弱陽性顆粒，部分間質可見弱陽性表達，其表達的meanIOD值為0.680 1±0.010 5。

2.2 HE4在子宮內膜間質與腺體中的表達比較

異位子宮內膜腺體與間質不同強度HE4陽性表達的頻數分布差異有統計學意義（χ2=15.038，P=0.000﹤0.01）；而正常內膜腺上皮及部分間質也有淡黃色著色（+），腺體及間質HE4陽性表達頻數分布差異有統計學意義（χ2=5.455，P=0.000﹤0.05）。見表1。

2.3 異位內膜中不同臨床分期HE4的表達

異位內膜組中Ⅰ～Ⅱ期HE4蛋白表達的meanIOD值為0.590 5±0.047；Ⅲ～Ⅳ期HE4蛋白表達的meanIOD值為0.571 9±0.008 2，兩者比較，差異有統計學意義（t=11.117，P=0.000<0.05），見表2。

2.4 異位內膜組織中HE4在增生期與分泌期的表達

在異位內膜組增生期與分泌期中HE4表達的meanIOD值分別為0.571 3±0.008 1和0.589 6±0.005 2，差異有統計學意義（t=10.496，P=0.000<0.05）。見表3。

2.5 異位內膜、正常內膜HE4在增生期與分泌期的表達

異位內膜組中增生期與分泌期HE4表達的meanIOD值分別為0.571 3±0.008 1和0.589 6±0.005 2；正常內膜組中增生期與分泌期患者子宮內膜腺體中HE4表達的meanIOD值分別為0.670 5±0.006 9和0.687 6±0.005 7，各組增生期與分泌期meanIOD值兩兩比較，差異有統計學意義（P =0.000<0.05）。見表4。

3 討論

子宮內膜異位癥是婦女的多發病、常見病，好發于生育期婦女，該病的發病率近年來逐漸增加。其基本病理變化為異位內膜組織病灶隨卵巢激素周期性變化發生出血，導致異位子宮內膜纖維組織增生，盆腔粘連，異位囊腫的增大，甚至破裂，并表現出相應的臨床癥狀引起患者不適、疼痛以及不孕，影響生活質量[4]。

該研究通過對異位內膜及正常內膜HE4的表達，發現HE4在異位內膜組織中的表達高于正常內膜，且腺體中的表達高于間質中表達；在子宮內膜的增生期表達高于分泌期的表達；在異位內膜r-AFS分期中高分期的表達要高于低分期的表達。推測HE4可能參與子宮內膜異位癥的發病，而且還可能與腺上皮高分泌有關。子宮內膜異位癥患者HE4表達水平的上調隨子宮內膜異位疾病r-AFS分期的進展程度而升高，病情程度越嚴重，其HE4的表達越高，在r-AFS高分期的子宮內膜異位癥中，由于HE4表達水平上調，使HE4發揮更強的作用及功能[4]，促使異位的子宮內膜細胞更為廣泛地種植、侵襲及生長，促進EMs的發生發展。異位內膜組與正常內膜組中HE4的表達，增生期均高于分泌期，提示增生期的子宮內膜的侵襲及遷移的能力高于分泌期。HE4可能在子宮內膜異位癥的發病及疾病的異地粘附、侵襲、生長中發揮著重要作用[8]。近年來國內外研究發現，經輸卵管逆流入盆腔或經侵入到子宮肌層的子宮內膜碎片中，必須有活的子宮內膜腺上皮和間質細胞，方可能發生移位生長、種植、并引起病變和相應的癥狀[5-7]。

綜上所述，此次研究標本來源于內蒙古自治區近2年的生育期婦女子宮內膜異位癥HE4的表達情況。還有待于進一步的擴大研究范圍，增加樣本量分析HE4在子宮內膜異位癥具體的發病機制，提出更為有力的證據。 同時，在腫瘤靶向治療[9-10]快速發展的今天，也可能為子宮內膜異位癥的靶向治療提供了一個新的思路。

[參考文獻]

[1] 豐有吉，沈鏗.婦產科學八年制[M].北京：人民衛生出版社，2005.

[2] Montagnana M， Lippi G， Danese E， et al. Usefulness of serum HE4 in endometriotic cysts[J]. British Journal of Cancer， 2009，101：548.

[3] 郎景和.子宮內膜異位癥研究的理論和實踐：發病、診斷和治療的“三化[J].中華婦產科雜志，2011（11）：801-802.

[4] Huhtinen K，Suvitie P，Hiissa J.Serum HE4 concentration differentiates malignant ovarian tumours from ovarian endometriotic cysts[J]. Br J Cancer，2009，100（8）：1315-1319.

[5] 浙江大學醫學院附屬婦產科醫院.子宮內膜異位癥診治熱點和進展[C]// 第一屆國際子宮內膜異位疾病和慢性盆腔疼痛熱點問題研討會.杭州：浙江大學醫學院附屬婦產科醫院，2015.

[6] Moore RG， Miller CM， Brown AK，et al. Utility of tumor marker HE4 to predict depth of myometrial invasion in endometrioid adenocarcinoma of the uterus[J].Int J Gynecol Cancer，2011，21（7）：1185-1190.

[7] Karolina Partheen， Brg Kristjansdottir， Karin Sundfeldt， et al. Evaluation of ovarian cancer biomarkers HE4 and CA-125 in women presenting with a suspicious cystic ovarian mass[J]. J Gynecol Oncol，2011，22（4）： 244-252.

[8] K Huhtinen， P Suvitie， J Hiissa， et al. Serum HE4 concentration differentiates malignant ovarian tumours from ovarian endometriotic cysts[J].Br J Cancer，2009，100（8）： 1315-1319.

[9] Chudecka-Gtaz A， Cymbaluk-Ptoska A， Menkiszak J， et al.HE4 tumor marker concentration in neoplastic peritoneal effusion and in peritoneal fluid associated with benign gynecological diseases[J].Ovarian Res，2014，7：22.

[10] Richards A， Herbst U， Manalang J，et al.HE4， CA125， the Risk of Malignancy Algorithm and the Risk of Malignancy Index and complex pelvic masses - a prospective comparison in the pre-operative evaluation of pelvic masses in an Australian population[J].Aust N Z J Obstet Gynaecol，2015，55（5）： 493-497.