臍血與成人外周血中淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力的分析

彭新國(guó) 安佳佳 董艷 王健 韓曉蓓

[摘要] 目的 探討臍血與成人外周血中淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力的關(guān)系。方法 2011年6月—2014年6月，從該院選取60例健康產(chǎn)婦志愿者和召集60例正常志愿者，分為觀察組和對(duì)照組作為臨床研究對(duì)象。取60例健康產(chǎn)婦志愿者分娩后的臍帶血進(jìn)行研究，同時(shí)對(duì)60例正常志愿者的外周血進(jìn)行研究，將兩組志愿者的淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力進(jìn)行對(duì)比，并分析討論。結(jié)果 觀察組和對(duì)照組志愿者在經(jīng)過(guò)淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力的觀察后，其中觀察組淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力低于對(duì)照組（如臍血和成人外周血 IFN-γ、 TNF-α、TNF-α、 IL-2、IL-4的t值分別為 46.738 2、 65.267 7、 54.904 3、18.404 6，P<0.05）。結(jié)論 臍血與成人外周血中淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力相比較，在一定范圍內(nèi)充質(zhì)干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力有關(guān)，對(duì)植物血凝素誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖具有抑制作用。

[關(guān)鍵詞] 淋巴細(xì)胞；細(xì)胞因子；流式細(xì)胞術(shù)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R392.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2016）03（c）-0048-03

Analysis of Umbilical Cord Blood and Adult Peripheral Blood Lymphocyte Cytokine Secretion Ability

PENG Xin-guo， AN Jia-jia， DONG Yan， WANG Jian， HAN Xiao-bei

Affiliated Hospital of Binzhou Medical College， Binzhou， Shandong Province， 256603 China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between umbilical cord blood and adult peripheral blood lymphocyte cytokine secretion ability. Methods 60 cases of healthy pregnant volunteers and 60 cases of normal volunteers treated in our hospital from June 2011 to June 2014 were selected and divided into the observation group and the control group， the umbilical cord blood of 60 cases of healthy pregnant volunteers and peripheral blood of 60 cases of normal volunteers were taken for research， the cytokine secretory capacities of lymphocytes of the two groups were compared， analyzed and discussed. Results The observation showed the cytokine secretory capacity of lymphocytes in the observation group was lower than that in the control group， the differences in the IFN-γ， TNF-α， TNF-α， IL-2 and IL-4 between umbilical cord blood and adult peripheral blood were statistically significant （t=46.738 2， 65.267 7， 54.904 3， 18.404 6， P<0.05）. Conclusion The comparison in cytokine secretory capacity of lymphocytes between umbilical cord blood and adult peripheral blood shows that the cytokine secretory capacity of mesenchymal stem cell is positively correlated with that of lymphocytes within a certain range， and it plays an inhibition role in lymphopoiesis induced by phytoagglutinin.

[Key words] Lymphocytes； Cytokine； Flow cytometry

臍帶血含有造血干細(xì)胞且易于采集[1]，又因其免疫原性弱等優(yōu)點(diǎn)，宜于臨床疾病治療，由此臍帶血間的充質(zhì)干細(xì)胞作為造血新種子細(xì)胞逐漸受到人們的關(guān)注[2]。國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為，骨髓間的充質(zhì)干細(xì)胞可對(duì)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和絲裂原刺激的T細(xì)胞增殖過(guò)程進(jìn)行抑制，通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子自分泌發(fā)揮轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的免疫調(diào)節(jié)作用[3-5]。臍帶血其間的充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞的作用及影響在目前臨床研究中尚未完全清楚，因此，該文作者對(duì)臍帶血其間的充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞的作用及影響進(jìn)行相關(guān)研究，在2011年6月—2014年6月中在該院選取60例健康產(chǎn)婦志愿者和召集60例正常志愿者作為臨床研究對(duì)象，觀察患者淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的表達(dá)，對(duì)臍帶血與淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力相關(guān)性進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從該院選取60例健康產(chǎn)婦志愿者和召集60例正常志愿者，分為觀察組和對(duì)照組作為臨床研究對(duì)象。其中觀察組60例女性年齡為20～60歲，平均年齡為（40.11±5.42）歲，平均體質(zhì)量為（56.82±9.56）kg，平均身高為（164.45±8.15）cm；對(duì)照組60例女性年齡為25～64歲，平均年齡為（40.77±6.77）歲，患者平均體質(zhì)量為（58.22±7.57）kg，平均身高為（163.77±4.77）cm。以上患者排除腫瘤患者和血液疾病等患者，健康狀況均為穩(wěn)定。在該研究實(shí)驗(yàn)進(jìn)行之前，以上所有參與實(shí)驗(yàn)志愿者均對(duì)該次實(shí)驗(yàn)有足夠了解，均屬自愿，簽署自愿協(xié)議文件，在研究過(guò)程中志愿者可隨時(shí)退出，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程貫徹倫理學(xué)原則。

1.2 方法

60例健康產(chǎn)婦志愿者和60例正常志愿者分別為觀察組和對(duì)照組。觀察組：將志愿者臍血中的單個(gè)核細(xì)胞分離后進(jìn)行培養(yǎng)：在無(wú)菌操作下采集志愿者臍血，使用肝素抗凝，分離出單個(gè)核細(xì)胞，使用10%含小牛血清和1×10-3 mol/L氫化可的松的IMDM培養(yǎng)液，而后將臍血單個(gè)核細(xì)胞放置培養(yǎng)瓶中，規(guī)格為1×109/L。在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，將液體換取，去除懸浮狀的細(xì)胞，3～4 d換液1次。7 d后使用2.5 g/L的胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA混合液消化傳代培養(yǎng)，使用第三代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組：使用含10%的小牛血清、10 mg/L植物血凝素的IMDM培養(yǎng)液將正常志愿者的外周血單個(gè)核細(xì)胞放置培養(yǎng)箱中，3 d后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，規(guī)格為1×109/L。觀察兩組淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的表達(dá)。參照Cytofix/CytoPerm Plus試劑盒說(shuō)明書(shū)和該實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞的固定、穿孔和流式細(xì)胞術(shù)（細(xì)胞因子的檢測(cè)）。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察兩組淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-4）能力的作用。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，該文研究項(xiàng)目將實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)準(zhǔn)確錄入到SPSS 19.0軟件中進(jìn)行處理，以95%作為可信區(qū)間。計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

將臍血、外周血中淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)刺激培養(yǎng)后產(chǎn)生細(xì)胞因子（INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-4）的百分含量，兩兩對(duì)應(yīng)相比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)表1。

3 討論

GVHD的發(fā)生可能性和其嚴(yán)重程度，在造血干細(xì)胞移植中與細(xì)胞因子分泌失調(diào)有密切的聯(lián)系[3]。細(xì)胞因子在GVHD損傷靶組織中占有重要地位[4]。該研究結(jié)果顯示成人外周血中淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)刺激培養(yǎng)后產(chǎn)生細(xì)胞因子的百分含量明顯高于臍血，數(shù)據(jù)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

該課題與以往研究淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力相關(guān)的課題相比，其創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在運(yùn)用易采集的臍血進(jìn)行研究，進(jìn)一步探討了人臍血、成人外周血中淋巴細(xì)胞在體外活化后胞內(nèi)細(xì)胞因子的變化，作者認(rèn)為臍血造血干細(xì)胞移植后是急、慢性GVHD發(fā)生低下的又一可能機(jī)制[5]。CD4+淋巴細(xì)胞按其所產(chǎn)生細(xì)胞因子的種類(lèi)不同，可分為T(mén)h1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。IFN-γ、TNF-α、IL-2主要由Th1細(xì)胞分泌，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，是引發(fā)GVHD的主要細(xì)胞因子。IFN-γ具有抑制病毒復(fù)制、調(diào)節(jié)免疫功能、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的抗瘤活性等多種生物學(xué)功能[6]；TNF-α具有抗腫瘤、參與免疫應(yīng)答等極為廣泛的生物學(xué)活性；IL-2可促使B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞增殖，活化體內(nèi)殺傷細(xì)胞，具有很強(qiáng)的抗腫瘤和抗病毒作用，并參與移植排斥反應(yīng)，還可以促使NK細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，促進(jìn)這些殺傷細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞和清除被病毒感染的細(xì)胞，以上3種細(xì)胞因子均可促進(jìn)或增強(qiáng)GVHD效應(yīng)。在我國(guó)相關(guān)專(zhuān)家學(xué)者彭新國(guó)，宿振國(guó)，紀(jì)冰等對(duì)臍血與成人外周血中T、B淋巴細(xì)胞分化抗原的相關(guān)分析中，他們認(rèn)為“臍血和成人外周血中的T、B零八細(xì)胞的含量存在一定程度上存在差異”，而這種差異主要和GVHD和發(fā)生率低、強(qiáng)度弱以及GVL效應(yīng)好有很大關(guān)系，在其研究中，臍血與成人外周血CD3+的比較中，臍血含量為（56.758±8.03），而成人外周血含量為（68.70±.5.95），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。除了CD4+/CD8+與CD3+CD19+以外，CD3+CD4+、CD3+CD8+都與血CD3+的比較相似[7]。在他們的研究中，與該研究類(lèi)似之處在于同是臍血與成人外周血中細(xì)胞因子分泌能力，但不同之處在于其從CD4+/CD8+、CD3+CD19+、CD3+CD4+、CD3+CD8+等細(xì)胞分化抗原方面入手，而該研究項(xiàng)目從IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4的水平表現(xiàn)進(jìn)行分析。

該研究表明，臍血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4的水平均明顯低于成人外周血。據(jù)研究結(jié)果，可以推測(cè)出這主要與臍血中淋巴細(xì)胞亞群的分布特點(diǎn)（以相對(duì)幼稚的CD45RA+淋巴細(xì)胞為主）及其分泌細(xì)胞因子的功能尚未完全成熟相關(guān)。進(jìn)一步說(shuō)明了臍血相對(duì)成人外周血中淋巴細(xì)胞的幼稚性和分泌細(xì)胞因子能力的低下。設(shè)想合理聯(lián)用細(xì)胞因子（IL-4）或應(yīng)用細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2等）拮抗劑在GVHD級(jí)鏈反應(yīng)發(fā)生前就阻斷其致病細(xì)胞因子的異常調(diào)節(jié)作用，可能是預(yù)防GVHD的發(fā)生或降低其強(qiáng)度、增強(qiáng)GVL效應(yīng)的途徑之一[8]。

綜上所述，研究成人外周血、臍血淋巴細(xì)胞活化后胞內(nèi)細(xì)胞因子的分泌特性，對(duì)闡明GVHD和GVL的可能機(jī)制有所幫助，該研究結(jié)果顯示成人外周血中淋巴細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子較為活躍，說(shuō)明臍血中淋巴細(xì)胞的幼稚性和分泌細(xì)胞因子能力的低下，因此該文作者建議在臨床分析明GVHD和GVL的可能機(jī)制時(shí)，可收集成人外周血進(jìn)行相關(guān)研究，以得到為精確的研究結(jié)果。

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