柴達木盆地梭梭LEA基因的擴增及序列分析

馬玉花　冶貴生　馮志鵬

摘要：為發(fā)掘梭梭（Haloxylonammodendron）抗逆相關(guān)基因，以柴達木盆地梭梭的同化枝為材料，擴增其LEA基因并進行了序列測定與分析。結(jié)果表明，所得柴達木盆地梭梭的LEA基因堿基數(shù)為234bp，其中A堿基70個，T堿基52個，G堿基59個，C堿基53個；氨基酸序列分析表明，所得LEA基因片段編碼78個氨基酸，其中強堿性氨基酸有12個，強酸性氨基酸有6個，疏水性氨基酸有34個，親水性氨基酸有26個。

關(guān)鍵詞：梭梭（Haloxyolonammodendron）；LEA基因；擴增；序列分析

中圖分類號：Q781 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）09-2383-03

梭梭（Haloxylonammodendron）為藜科（Chenopo-diaceae）梭梭屬（Haloxylon Bunge）多年生小喬木。主要分布在中國新疆、青海、內(nèi)蒙古、甘肅的半荒漠和荒漠地區(qū)。柴達木盆地氣候高寒干燥，蒸發(fā)量大降水量小，盆地沙漠化和鹽漬化嚴重。梭梭作為柴達木盆地早生、鹽生荒漠植被的主體，長期生長于干旱、鹽堿的環(huán)境中，具有很強的抗旱、耐鹽堿性，因而梭梭響應(yīng)干旱、鹽等非生物脅迫的生理生化機制研究備受重視。胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（LEA）是在棉花胚胎發(fā)育后期的子葉中大量累積的一類蛋白質(zhì)，因而被稱為胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白，現(xiàn)已證明LEA蛋白不僅廣泛存在于植物中，也存在于細菌和無脊椎動物中，Dure等根據(jù)氨基酸序列或親水性結(jié)合每個LEA家族特有的保守序列，將LEA蛋白劃分為6個家族，Battaglia等后來依據(jù)棉花中已獲得的LEA蛋白氨基酸序列的同源性將LEA蛋白分為七類。大量的研究表明，LEA參與了植物對干旱、鹽、低溫等環(huán)境脅迫的響應(yīng)，LEA蛋白可被各種脅迫條件誘導(dǎo)而大量產(chǎn)生，在植物脫水耐受中發(fā)揮重要作用。目前，有關(guān)梭梭LEA基因的研究鮮見報道。本試驗對柴達木盆地梭梭進行LEA基因克隆的基礎(chǔ)上，下一步對LEA基因的核苷酸序列和氨基酸序列進行了分析，以期為LEA基因的表達特性及功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

供試梭梭的種子采自青海省柴達木盆地，實驗室育苗后取同化枝進行總RNA的提取。RNA提取試劑盒為北京艾德來生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Ex-TaqDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、DL2000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司。

參照試劑盒說明提取梭梭總RNA，根據(jù)已發(fā)表的LEA基因序列設(shè)計擴增引物，由大連寶生物工程有限公司合成，預(yù)期目的片段長度為234bp。引物為LEA-F（5'-ATGGCTCGCTCTATCTCTAACG-3）、LEA-R（5-AGCCGCATGATFAGCAGG-3）。RT-PCR過程為取梭梭總RNA5μL，NHX-R4μL，DNTP Mixture3μL，RNase-FreeddH₂O3μL，70℃預(yù)熱5min，立即冰浴2min，加入5倍的反轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL，反轉(zhuǎn)錄酶1μL，置于42℃水浴50min，95℃5min，補加RNase-FreeddH₂O至總體積為50μL。PCR擴增程序：94℃1min，55℃1min。72℃1min，35個循環(huán)，72℃10min。將擴增正確的PCR產(chǎn)物送交生物公司進行序列測定，應(yīng)用DNASTAR軟件對LEA基因序列進行分析，用Blast程序進行序列同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 梭梭總RNA提取

提取的梭梭總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測表明（圖1），RNA所在泳道28S和18S條帶清晰，28S為18S的兩倍，總RNA質(zhì)量可以滿足后續(xù)試驗的要求。

2.2 梭梭LEA基因PCR擴增結(jié)果

將LEA基因的PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明（圖2）LEA基因所在泳道出現(xiàn)目的條帶。大小與預(yù)期的234bD長度相符。

2.3 LEA基因核苷酸序列和氨基酸序列分析

2.3.1 核苷酸序列和氨基酸序列分析

梭梭LEA基因核苷酸序列經(jīng)DNASTAR軟件分析后，結(jié)果表明（表1、表2），LEA基因核苷酸序列長度為234bp，整個基因序列中A+T的含量高于G+C的含量，氨基酸序列長度為78aa，分子量為8301.34Da，等電點為10.15。各類氨基酸中堿性和酸性氨基酸的含量分別為15.4%和7.7%，疏水性和親水性氨基酸的含量分別為43.6%和33.3%。

2.3.2 梭梭LEA基因與參考基因核苷酸序列和氨基酸序列比較 將獲得的梭梭LEA基因與Genebank中登錄的梭梭（Haloxylon aammodendron，JQ277729.1）、海馬齒（Sesuvium portulacastrum，HQ427488.1）、甜菜（Beta vulgaris subsp，Vulgaris，LOC104898925）、長葉紅沙（Reaumuria trigyna，KC701476.1）、茶（Camellia sinensis，JN400595.1）、阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana，AK228151.1）、可可（Theobroma cacao，XM007050896.1）、胡楊（Populuseuphratica，XM011011893.1）、荷花（Nelumbo nu-cifera，XM010261212.1）、橙子（Citrus sinensis，NM001289140.1）、黃瓜（Cucumis sativus，XM004165868.1）、牧豆（Prosopis juliflora，D0645423.1）等植物的LEA基因核苷酸序列與氨基酸序列進行同源性比較。結(jié)果表明（圖3、圖4），所得梭梭LEA基因序列與非梭梭屬植物L(fēng)EA基因序列間存在著豐富的變異，其核苷酸序列的同源性在48.3%-79.3%之間，氨基酸序列同源性在34.6%～75.7%之間，而與已登錄的梭梭LEA基因核苷酸序列同源性為99.6%，氨基酸序列同源性為100.0%，說明梭梭LEA基因核苷酸序列的變異因密碼子的簡并性而屬同義突變。

3 小結(jié)與討論

胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白（LEA）是當(dāng)前逆境生理學(xué)研究的熱點之一，前人的研究表明，在逆境脅迫下，胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白大量積累并提高了植物的抗性，說明LEA蛋白積累是植物對環(huán)境適應(yīng)的重要表現(xiàn)，LEA蛋白與植物抗逆性密切相關(guān)。本試驗通過對柴達木旱生、鹽生植物梭梭的LEA基因的克隆、序列分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測，將為柴達木盆地梭梭抗逆機理的闡明奠定基礎(chǔ)。

本試驗獲得的柴達木盆地梭梭LEA基因總長234bp，編碼78個氨基酸，序列比對分析表明柴達木盆地梭梭LEA基因核苷酸序列與不同科屬植物L(fēng)EA基因的同源性在48.3%-79.3%之間：氨基酸序列同源性在34.6%-75.7%之間，而與已發(fā)表的內(nèi)蒙古巴丹吉林沙漠梭梭LEA基因的核苷酸序列存在一定的差異性，其同源性為99.6%，氨基酸序列同源性為100.0%，可見不同地域和自然環(huán)境的梭梭雖然其核苷酸序列上有一定的變異，但其氨基酸序列相同，未發(fā)生突變，這既保證了不同環(huán)境下梭梭LEA基因的一定程度的變異，也保證了NHX蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能的正常發(fā)揮。