豇豆愈傷組織誘導的初步研究

陳高　陳禪友　高志鵬　宋靖儀　吳華

摘要：研究了不同濃度的生長素（NAA、2，4-D）和細胞分裂素（6-BA、KT）對豇豆[Vignaunguiculata（Linn.）Walp.]花榮下胚軸和子葉愈傷組織誘導的影響。結(jié)果表明，子葉較下胚軸更容易誘導出愈傷組織；子葉切片在MS+3.0mg/L2，4-D+0.5mg/LKT中愈傷誘導率最高，為95.83%，下胚軸莖段在MS+3.0mg/L2，4-D+0.1mg/L6-BA中愈傷誘導率最高，為88.89%。此外，2，4-D與KT組合可誘導子葉產(chǎn)生胚狀體。

關鍵詞：豇豆[Vignaunguiculata（Linn.）Walt）.]；外植體；愈傷組織；誘導；生長素；細胞分裂素

中圖分類號：S643.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）09-2380-03

豇豆[Vignaunguiculata（Linn.）Walp.]是豆科豇豆屬一年生草本植物。豇豆在中國品種資源豐富，歷史悠久，適應性強，栽培范圍廣，是中國夏秋兩季主要食用的蔬菜之一。新鮮的豇豆莢，維生素及礦物質(zhì)含量豐富，蛋白質(zhì)含量較高，其磷脂有利于促進胰島素的分泌，是糖尿病人的理想食物。

植物組織培養(yǎng)是細胞工程技術(shù)中研究較早、較成熟的技術(shù)。在育種上已經(jīng)得到普遍應用，如單倍體育種、細胞融合和基因工程等。此外。植物組織培養(yǎng)技術(shù)還被運用到人工種子的生產(chǎn)和種質(zhì)資源的保存上，大大節(jié)約了人力、物力，避免了外界氣候和其他環(huán)境因素對播種的影響。

近年來，國內(nèi)外學者對豇豆組織培養(yǎng)進行了一些研究，包括基因型、外植體種類和大小、培養(yǎng)基種類、凝固劑、細胞分裂素前處理以及激素種類與配比等對不定芽和愈傷組織誘導的影響。基因型和外植體類型對不定芽和愈傷組織誘導的影響差異明顯，至今尚未形成一種比較通用的豇豆不定芽和愈傷誘導的組培體系。本試驗以豇豆花榮的下胚軸、子葉作為外植體進行豇豆愈傷組織誘導，研究不同激素配比的培養(yǎng)基對愈傷組織誘導產(chǎn)生的不同影響，找到適合豇豆花榮愈傷組織誘導的理想培養(yǎng)基，為豇豆的組織快速繁殖和品種改良研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

豇豆花榮種子，由湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心提供。

選擇無皺粒、飽滿、大小均勻的豇豆種子，用75%乙醇浸泡消毒40s后，經(jīng)無菌水沖洗2-3次：然后用升汞浸泡消毒9～10min，再用無菌水沖洗6-8次。將消毒后的種子接種于裝有MS基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每瓶4-5粒，在（23±2）℃、16/8h光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。種子萌發(fā)后，當幼苗高達到5-6cm、子葉轉(zhuǎn)綠時作為外植體材料。

1.2 生長調(diào)節(jié)劑對無菌苗不同部位愈傷組織誘導的影響

分別切取幼苗的下胚軸和子葉作為外植體，接種至含有不同濃度NAA或2，4-D（1.0、3.0、5.0mg/L）與6-BA或KT（0、0.1、0.5mg/L）的MS培養(yǎng)基中，每個處理接種4皿，每皿接種12-16個外植體，4次重復。其中下胚軸切取大小在5mm左右，子葉橫切段厚度在2mm左右。每15d換一次新鮮培養(yǎng)基，所有材料均是在（23±2）℃、16/8h光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

接種后，每3d觀察愈傷組織誘導情況，并記錄愈傷組織誘導率、愈傷組織色澤狀態(tài)等相應指標。同時進行拍照記錄和形態(tài)解剖。

1.3 數(shù)據(jù)分析

愈傷分化率：誘導出愈傷的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%：褐化率：褐化的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%：胚狀體誘導率：誘導出胚狀體的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%，所有數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel2003和SAS8.02軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素對豇豆子葉愈傷組織誘導的效果

預試驗中發(fā)現(xiàn)，豇豆轉(zhuǎn)綠且飽和的子葉較白色或轉(zhuǎn)綠萎蔫的子葉愈傷誘導效果更佳，因此，本試驗中均采用轉(zhuǎn)綠且飽和的子葉進行試驗。不同生長索及細胞分裂索處理對豇豆子葉切片15d愈傷誘導效果的差異明顯（表1）。由表1可知，2，4-D比NAA更利于子葉愈傷組織誘導分化，隨著2，4-D濃度的增高，褐化率明顯降低，在3.0mg/L2.4-D+0.1mg/L6-BA培養(yǎng)基中，愈傷誘導率達到最高（100%），且額外添加KT比6-BA能顯著增加愈傷組織中胚狀體的形成比例。

MS+3.0mz/L2，4-D+0.5mg/LKT配置的培養(yǎng)基上形成的愈傷組織色澤黃亮，顆粒飽滿，易分散，而褐化率僅為34.58%。切片分析結(jié)果表明，愈傷組織中所形成的胚狀體。細胞壁薄。原生質(zhì)較濃、細胞核較大，細胞正處于旺盛的分裂狀態(tài)，生長速度快。由此可見，MS+3.0mg/L2，4-D+0.5mg/LKT是豇豆花榮子葉愈傷誘導與胚狀體誘導的最佳培養(yǎng)基，愈傷誘導率為95.83%，胚狀體誘導率為78.13%。

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對豇豆下胚軸愈傷組織的影響

表2結(jié)果表明，2種生長素均能誘導豇豆下胚軸愈傷的形成，但在加入相同濃度的6-BA或KT時，2，4-D的愈傷誘導率較高、愈傷較為疏松，且褐化率明顯降低。研究中發(fā)現(xiàn)，在2，4-D濃度相同。添加同濃度6-BA或KT時，KT的愈傷誘導率大部分高于6-BA，誘導出的愈傷大多為淡黃色。后期培養(yǎng)更易褐化。由此可見，MS+3.0mg/L2，4-D+0.1mg/L6-BA是豇豆花榮最佳的愈傷誘導培養(yǎng)基，愈傷誘導率為88.89%，褐化率為34.44%。

3 小結(jié)與討論

愈傷誘導會因外植體的年齡、部位、生理狀況而有所差異。包英華等研究豇豆豐產(chǎn)2號的愈傷組織誘導時，發(fā)現(xiàn)愈傷誘導率下胚軸>頂芽>上胚軸>真葉。本研究中，發(fā)現(xiàn)豇豆花榮子葉較下胚軸的愈傷誘導率高，且子葉能夠誘導出胚狀體。

植物生長素是影響外植體愈傷誘導和分化的關鍵。在豇豆愈傷誘導的研究中，Ramakrishnan等和Anand等發(fā)現(xiàn)1.5mg/L的2，4-D對胚性愈傷的誘導效果，在胚性愈傷及原胚形成這個階段是最好的。對豇豆未成熟胚進行愈傷誘導時，較高濃度的2，4-D和較低濃度的6-BA配合使用，胚性愈傷的誘導率更高。在豇豆豐產(chǎn)2號的愈傷組織誘導的研究中，愈傷誘導率也因外源激素的濃度不同而有所差別，NAA和2，4-D的愈傷誘導效果大致相同，其最佳用量為2.0mg/L。本研究中發(fā)現(xiàn)，2，4-D對子葉和下胚軸的誘導效果均優(yōu)于NAA，褐化情況較少。當2，4-D達到3.0mg/L時，只需要3～6d便能啟動愈傷組織的發(fā)生，平均誘導率可高達70%。而NAA誘導的愈傷出愈率低。易褐化。但有利于生根。KT與2，4-D組合有利于子葉的愈傷誘導和胚狀體的形成，而6-BA與2，4-D組合有利于下胚軸的愈傷誘導。

褐化主要是酶促褐變，而酶促褐變主要是由多酚氧化酶引起的。植物種類和基因型、外植體部位和生理狀態(tài)、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件是影響褐化的因素。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，子葉比下胚軸莖段褐化嚴重，凡是較小、較薄、綠色較淺、帶有機械傷的子葉容易發(fā)生褐化，較嫩帶綠色的下胚軸褐化較輕，而較老的褐化較重。為了避免褐化過于嚴重，試驗中縮短了繼代周期，有效地改善了褐化。