污染土壤中重金屬Cr吸附菌株的篩選與鑒定

李軍　楊卓　紀宏偉　門明新

摘要：以Cr污染土壤為菌源樣品，富集培養與菌株分離后，采用二苯碳酰二肼分光光度法從中篩選Cr吸附菌株，共篩選分離出4株高效吸附重金屬Cr的細菌菌株。通過形態觀察、生理生化試驗對4株菌株進行了種屬鑒定，初步鑒定4株菌株均為芽孢桿菌（Bacillus）。

關鍵詞：土壤污染；重金屬Cr；吸附；菌株篩選；種屬鑒定

中圖分類號：X53 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）09-2218-04

隨著社會經濟和工農業的發展，中國甚至全球許多國家面臨嚴重的Cr污染威脅，土壤Cr污染已成為人們普遍關注的環境污染問題之一。Cr鹽、皮革、印染、電鍍等涉Cr工業的發展以及城市污水的非達標排放對農業土壤已造成一定的毒害，其危害由于生物放大作用也逐漸威脅人類健康。因此，Cr被列為中國農田土壤環境質量評價的8個重金屬控制指標之一。

土壤中的Cr最初來源于巖石風化，在自然條件作用下轉移到成土母質及土壤中：其次，隨著城市化的推進。城市污水灌溉、污泥及城市垃圾正在成為土壤Cr的另一個主要來源；另外，隨著冶金、制革、電鍍等涉及Cr污染工業的發展，某些工廠和Cr污染源所產生的含Cr粉塵、Cr渣及被Cr污染的地下水也能通過各種途徑進入土壤造成Cr的累積。通常，低濃度的Cr對多種農作物的生長有刺激作用，但是高濃度的Cr則會危害農作物。另一方面人類食用Cr含量超標的糧食、蔬菜后，進入人體，很可能會誘發多種慢性疾病的發作。

Cr污染土壤的治理途徑主要有兩種：一是改變Cr在土壤中的存在形態，將Cr⁶⁺還原成Cr³⁺，降低其在環境中的遷移能力和生物可利用性：二是將Cr從被污染土壤中清除。根據以上兩種思路發展出生物修復、工程修復、加入改良劑及農業措施等治理方法，但是生物修復技術中利用微生物處理污染土壤中重金屬Cr是目前實踐證明最有發展前途的一種新的重金屬污染處理方法，與傳統的處理方法相比，其具有無二次污染、處理效率高、適應范圍廣、成本低等優點，在治理土壤重金屬污染中有著很大的應用前景，具有很高的研究價值。本研究目的是從污染土壤中篩選、分離高效吸附重金屬Cr的細菌菌株。并且對吸附能力較高的菌株進行種屬鑒定，以期為生物技術治理土壤Cr污染提供菌種資源，并為其進一步研究奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1 菌源樣品

污染土樣：采用五點法，取污水處理廠周邊（表1）的土壤樣品混合。鏟去表面土層。取5-10cm深處的土壤，裝入無菌袋，記錄取樣地點、時間等，帶回實驗室，4℃冰箱保藏備用。

1.2 培養基

1.2.1 菌株分離篩選培養基 ①基礎培養基。NA培養基：用于菌株的分離及保存；NB培養基：用于菌株液體培養及種子制備。⑦富集培養基。含100、300、500mg/LCr⁶⁺的液體培養基，用于重金屬Cr吸附菌株的富集培養。③初篩培養基——分離培養基。NA培養基基礎上添加終濃度為500mg/L的Cr⁶⁺，用于菌株分離、馴化。

1.2.2 復篩培養基

NB培養基，用于菌株培養獲得菌泥，以測定菌株對Cr的吸附能力。

1.2.3 菌種鑒定培養基

根據常見細菌系統學鑒定手冊配制。

1.3 試驗方法

1.3.1 Cr吸附菌株的分離篩選——菌株的富集、分離及純培養 取5.0g土樣于含100mg/LCr⁶⁺的液體富集培養基中搖床培養3d，轉接3次，富集培養液的Cr⁶⁺濃度以200mg/L遞增，直到Cr⁶⁺濃度達到500mg/L。將馴化后的菌株培養液涂布于含500mg/L Cr⁶⁺的NA培養基中，37℃培養。將菌落生長特征不同的菌株挑取到NA斜面上培養，37℃培養至菌苔長滿，置于4℃冰箱備用，用于進一步地篩選、鑒定。

1.3.2 Cr⁶⁺標準曲線的繪制 向一系列50mL比色管中分別加入0、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00和10.0mL Cr⁶⁺標準溶液，用水稀釋至標線。向比色管中加入2mL顯色劑。搖勻，放置10min，在540nm波長下，以去離子水作為參照。測量吸光度。繪制Cr⁶⁺含量對吸光度的標準曲線。

1.3.3 菌株復篩——菌株吸附Cr⁶⁺能力測定 制備初篩菌株的菌泥備用。三角瓶中裝入濃度為1000μg/L的Cr⁶⁺標準液，接入菌泥，充分振蕩搖勻后搖床培養，以不接菌泥作為對照。每1h取樣1次，以5000r/min離心10min，采用二苯碳酰二肼顯色一紫外分光光度法測定上清液中Cr⁶⁺的濃度，以此確定各菌種對Cr⁶⁺的吸附情況。每個樣品3次重復。按以下公式計算菌體對Cr⁶⁺的吸附率（Q）：Q：[（C₀-C_t）/C₀]×100%。式中，C為重金屬離子初始濃度（mg/L），C_t為重金屬離子平衡濃度（mg/L），挑選出吸附效果最好的菌種，用于菌株種屬鑒定。

1.4 菌株種屬鑒定

首先進行菌落形態觀察，將所得菌株劃線接種于固體平板上，37℃培養24h，觀察單菌落形態。然后進行革蘭氏染色試驗，最后進行生理生化試驗，根據常見細菌系統學鑒定手冊進行。

2 結果與分析

2.1 Cr吸附菌株的富集與分離

通過對菌液進行觀察發現，隨著Cr⁶⁺濃度的增加，菌落的數量明顯減少。Cr⁶⁺濃度為500mg/L時，選擇合適稀釋濃度涂布的培養基平板，對生長較好的細菌進行分離純化，得到18株形態各異的Cr吸附細菌，編號為A-1、A-2、B-1、B-2、C-1、CX-9-1、CX-9-2、D-1、E-1、E-2、F-1、G-1、H-1、I-1、K-1、M-1、N-1、O-1，將所篩選的菌株接種到NA斜面培養基上備用。

通過對18株菌株的菌落形態觀察，初步判斷為細菌菌落，圓形或近圓形、濕潤不透明，詳細描述見表2。

2.9 菌株吸附Cr⁶⁺能力測定

Cr⁶⁺濃度（x）與吸光度（y）的標準曲線見圖1，各菌株對Cr的吸附情況見表3。由表3可以看出，菌株對重金屬Cr的吸附作用存在差異，按2h時的吸附能力排序為H-1=M-1>CX-9-1>CX-9-2>E-1=G-1>F-1>N-1>0-1>A-1>I-1>B-1>K-1>B-2>D-I>A-2>E-2>C-1，其中對重金屬Cr吸附效果排前4位的4株菌株在處理2h時的吸附率分別達98.86%、98.86%、97.02%、96.73%，說明這4株菌株具有較好的應用前景。

2.3 4株菌株的種屬鑒定

2.3.1 菌落特征 CX-9-1菌落直徑為1.0cm，呈圓形，白色，邊緣不整齊，容易挑取，中間有隆起，菌落不透明，有褶皺，表面干燥：CX-9-2菌落直徑為0.9cm，呈圓形，白色，邊緣整齊，不容易挑取，中間有隆起，菌落不透明，無褶皺，表面干燥；H-1菌落直徑為0.3cm，呈圓形，微黃色，邊緣不整齊，容易挑取，扁平，菌落不透明，無褶皺，表面濕潤：M-1菌落直徑為0.2cm，呈不規則圓形，微黃色，邊緣整齊，不容易挑取，中間有隆起，菌落不透明，無褶皺，表面濕潤（表2）。根據以上形態特征初步判斷4株菌株均為細菌菌落，菌落形態見圖2。

2.3.2 菌體形態特征 供試菌株經革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，都為桿菌，CX-9-1、M-1革蘭氏染色呈陽性（圖3）。

2.3.3 生理生化試驗結果 生理生化試驗包括V.P試驗、硝酸鹽還原試驗、淀粉水解試驗、接觸酶試驗、葡萄糖氧化發酵試驗、檸檬酸鹽試驗等18項，試驗結果如表4所示，根據試驗結果與《常見細菌系統鑒定手冊》作初步判斷，判定CX-9-1、CX-9-2、H-1、M-1四株菌株均為芽孢桿菌（Bacillus）。結果為土壤Cr污染的微生物治理提供了菌種資源，并為其進一步深入研究奠定了科學基礎。

微生物吸附法去除土壤中Cr⁶⁺的研究較少。Srivastava等研究表明，土壤中Cr⁶⁺含量為250mg/kg、黑曲霉作為吸附劑時，15d內Cr⁶⁺的去除率為75%。萬俊杰等利用微生物代謝產生的γ-聚谷氨酸絮凝劑對含Cr⁶⁺廢水進行Cr⁶⁺去除處理，結果顯示，pH為4，30mL30mg/L的廢水中添加γ-聚谷氨酸1.5mL和1%CaCl₂2.4mL時，Cr⁶⁺的去除率可達55%。盛姣等通過試驗得出微生物發酵米糠對Cr⁶⁺的最佳吸附條件為微生物發酵米糠濃度10g/L、溫度60℃、pH2、Cr⁶⁺質量濃度不超過40mg/L、吸附平衡時間40min時，吸附率達95.7%。Valerie等將含Cr泥土與鏈霉菌在培養基中混合培養，發現當泥土中Cr⁶⁺濃度為1800mg/kg時，經過30d后，去除率達到100%。本研究中篩選出的4株菌株較上述各研究中對Cr的吸附率更高，應用前景更廣，可以將這些菌株進行進一步試驗研究，探討溫度、pH、初始Cr濃度等因素對其吸附Cr的影響。

關于土壤Cr污染的生物技術治理，國內外學者們已經進行了大量相關研究，篩選出一些重金屬Cr吸附菌株，如硫酸鹽還原菌、芽孢桿菌屬、埃希氏菌屬、陰溝桿菌、大腸桿菌、假單胞菌屬等。胡勇等從不同來源的樣品中分離出吸附Cr⁶⁺較強的菌株X07，經鑒定為蠟狀芽孢桿菌（B.CereUS）：周鳴等從污染土壤中分離出地衣芽孢桿菌（B.licheni-formais），利用其死菌體進行Cr6+吸附動力學研究；魏斐等篩選出的去除Cr⁶⁺的菌株經鑒定為蘇云金芽孢桿菌（B.mucilaeinosus），本試驗中篩選出的菌種均為芽孢桿菌，與前人的研究結果相一致。由此可見，芽孢桿菌屬細菌在土壤重金屬Cr污染的治理中具有十分廣闊的應用前景。