細菌生物被膜定性和定量研究方法

陳朝喜

摘要：細菌生物被膜是浮游細菌和生物被膜細菌共同分布于同一生存空間內的特殊生長方式，能夠逃避抗生素和機體免疫系統的清除而得以繼續生存。對細菌生物被膜定性和定量方法進行了綜述，比較和分析了其優缺點，旨在評價各種方法在生物被膜研究中的適用性。

關鍵詞：細菌生物被膜；浮游細菌；定性方法；定量方法

中圖分類號：Q939.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）09-2177-04

細菌生物被膜是細菌將其自身包裹在其分泌物內形成的一種特殊復合體，具有不同于浮游細菌的一些特殊性質，如生物被膜形成后造成細菌對外界環境的抵抗能力增強，在臨床上形成對常用抗菌藥物的耐受性，使得細菌性感染疾病遷延不愈和持續反復發作，給疾病治療帶來一定的難度。隨著研究方法的發展和多學科研究領域的交叉和拓寬，近年來細菌生物被膜的定量和定性研究方法越來越完善，這些方法根據原理大致可分為三類：①基于生物被膜胞外基質和生物被膜內的總細胞數量（包括活細胞和死亡細胞）的定量試驗：⑦基于活細胞的活菌計數試驗：③基于生物被膜胞外基質成分的定量試驗。在相關研究中，研究者對生物被膜的結構、活性和細菌組成動態變化規律等方面研究取得了很大的進展，尤其是無損傷的、原位的和在線的技術能夠提供自動的、快速的和實時的信息，為生物被膜的研究提供了新的思路和方法。本文分析和比較了幾種常用生物被膜定性和定量方法在生物被膜生物量研究中的優缺點，以期評價各方法在生物被膜研究中的適用性。

1 常用生物被膜定性研究方法

生物被膜定性研究方法主要借助各種染色方法（如銀染法）、光學和光譜學方法（如光學和電子顯微鏡技術等）進行生物被膜檢查和監測，尤其是顯微檢查技術在觀察選取生物被膜細菌群體的結構參數和構效關系方面具有明顯的優勢。在生物被膜定性研究中，最常用的方法有以下幾種。

1.1 快速銀染法

快速銀染法主要用于細菌生物被膜的初步研究。其基本原理是通過快速銀染法能夠將細菌生物被膜中的多糖蛋白復合物染成灰褐色或灰黑色，通過銀染能夠初步判斷不同培養階段生物被膜中多糖蛋白復合物的動態變化規律，其操作步驟具體包括10個操作步驟：①基質材料表面浮游菌去除：②戊二醛固定；③蒸餾水漂洗；④氯化鈣結合；⑤蒸餾水漂洗；⑥硝酸銀染色；⑦對苯二酚顯色；⑧蒸餾水漂洗：⑨硫代硫酸鈉固定：⑩蒸餾水漂洗。

1.2 玻璃試管法

其原理是根據氣-液界面形成染色環狀物的顏色深淺來判定細菌生物被膜的形成能力。常用的染料有結晶紫和剛果紅等，由于該方法存在一定的主觀誤差，因此主要用于生物被膜形成能力的初步篩選。

1.3 基于電子顯微鏡的定性方法

借助原子力顯微鏡、透射掃描電鏡和激光聚焦顯微鏡等對細菌生物被膜進行觀察，能夠對生物被膜的立體結構進行定性分析。尤其是相關染料與激光共聚焦顯微鏡相結合，能夠實現對生物被膜中細菌生理狀態的定性和定量分析。相關電子顯微鏡定性研究方法的缺點是實驗條件要求較高，實驗設備較貴重，因此不常用于常規檢測和研究。隨著電子顯微鏡技術的發展，近年來，在實際的科研中。電子顯微鏡相關技術常與染色技術和分子生物學技術結合，廣泛應用于細菌生物被膜的定性和定量研究。

2 生物被膜定量研究方法

2.1 瓊脂平板菌落計數法

瓊脂平板計數法是一種最基本的菌落計數法，在實際的實驗操作過程中不僅勞動強度大，而且費時，同時誤差較大，不適宜大樣本觀察。雖然可以通過多次計數求平均值的方法來減小實驗誤差，然而這樣無疑會增大工作量和強度，因此在實際實驗中很少單獨采用，常常結合其他方法對細菌生物量進行定量研究。在生物被膜細菌計數過程中，需要輔助手段將生物被膜中的細菌游離，輔助手段對被膜細菌的影響也制約著瓊脂平板菌落計數法的重復性。

2.2 結晶紫（CV）染色法

結晶紫是一種堿性染料，能夠結合生物被膜表面帶負電荷的表面分子和胞外基質中的多糖成分，通過測定吸光度來對細菌生物被膜形成能力進行鑒定和分型。由于生物被膜中的胞外基質成分和細菌本身（包括活細胞和死亡細胞）均能被結晶紫染色，因此改良結晶紫方法尤其不適合用于對抗菌藥物或者其他化學物質對生物被膜內細菌殺傷效果的評價。在研究中常用來對細菌生物被膜下次形成能力進行初步篩選和鑒定。

1985年Christensen等首次采用結晶紫染色方法對非黏液性鏈球菌生物被膜進行了定量分析，2000年，Stepanovic等對結晶紫方法進行改進，增加了結晶紫染色方法對細菌生物被膜定量的準確性，其能夠對微孔板生物被膜生物量進行較為全面的量化。然而，結晶紫染色方法在銅綠假單胞桿菌生物被膜定量中具有較大的批內和批間誤差，其原因可能與銅綠假單胞桿菌含有較多的水通道導致其生物被膜固定不充分有關。

2.3 Syt09/PI染色法

Syto9是一種能夠對核酸進行染色的熒光染料.能夠通過被動擴散的方式實行細胞膜與細菌菌體（包括活細胞和死亡細胞）的DNA結合。由于死亡細胞的細胞膜通透性改變和碘化丙啶（PI）只能穿過不完整的細胞壁的特點，PI可以進入死細胞實現對死亡細胞的染色。由于DNA也是胞外基質的一部分，因此可以通過對DNA的結合間接反映生物被膜總生物量的變化規律。

隨著科研儀器的發展，尤其是激光共聚焦顯微鏡（CLSM）的應用之后。除了對生物被膜組成成分和形態學的研究外，Syto9/PI還常常用于細菌和酵母菌生物被膜生物量的研究。需要指出的是，在進行Syto9/PI染色時，為獲取穩定的熒光信號。在測定之前需對菌株進行一段時間的孵育，而且孵育時間對不同的菌株影響較大。

2.4 MTT/XTT試驗

許多四唑鹽類染料如5-氰基-2，3-二-（p-芐基-四唑氯化物）（CTC）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTF）、2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽（CCK-8）和3，3-[1-（苯氨酰基）-3，4-四氮唑]-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸鈉（XTT）均能夠實現對生物被膜中活細胞進行相對的定量，而且能夠區別生物被膜中活細胞和死亡細胞。其中MTF/XTT試驗是以活細胞的代謝能力為基礎的定量化技術，是行之有效的方法之一。

活細胞線粒體中含有的琥珀酸脫氫酶能將加入的MTF/XTT代謝成為化合物甲月贊，利用酶標儀在570nm處測定細胞上清液的吸光度來反映活細胞的代謝能力，因此可根據光密度OD值推測出活細胞的數目，已經被廣泛應用在懸浮細胞的定量化以及細菌和酵母生物被膜的定量研究中。然而由于其自身不可避免的種內和種間變異較大的缺點限制了其在實際中的應用，只能用來檢測細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數，因此在利用酶標儀檢測結果的時候必須保證試驗結果在線性范圍內。此外，由于XTT水溶液不穩定，因此最好低溫保存或現配現用。

2.5 試鹵靈試驗

刃天青又稱阿爾瑪藍。是一種藍色的化合物，可以被活細胞代謝成具有熒光活性的粉紅色的試鹵靈（Resorufin）。這種方法主要用于哺乳動物細胞的活性分析，也被廣泛應用于真菌、結核桿菌、表皮葡萄球菌和變形鏈球菌的藥敏試驗。

2.6 熒光二乙酸（FDA）試驗

活的微生物細胞能夠利用其自身非特定內源性和外源性酯酶將無色的、非熒光特性的熒光二乙酸（FDA）轉化成黃色的、高熒光特性的熒光物質。FDA已廣泛用于土壤和垃圾中總微生物的活性監測，也廣泛應用于生物被膜生物量的定量研究。

需要指出的是，在熒光二乙酸鈉（FDA）試驗中，為了增加生物被膜中活細胞的熒光強度，必須通過降低對照孔的熒光信號干擾來實現測定結果的最優化。此外，在利用該方法對不同種屬細菌生物被膜生物量進行定量分析時，營養條件和菌株的生理特征等因素都會影響其靈敏度和重復性，因此需要建立標準曲線來校正。

2.7 1，9-二亞甲基藍（DMMB）試驗

生物膜的一個重要組成部分——胞外基質的定量也越來越引起大家的關注。研究表明，染料1，9-二亞甲基藍（DMMB）能夠和生物被膜胞外基質的硫酸聚糖絡合形成一種不溶性的復合物，通過添加一種解聚試劑來間接測定和衡量生物被膜中硫酸多糖的含量。DMMB最初用于軟骨細胞培養液中硫酸多糖的定量研究和金黃色葡萄球菌生物被膜胞外基質的定量研究。

2.8 多糖蛋白復合物（GLX）的測定——色氨酸定量試驗

國內外學者采用色氨酸定量試驗對生物被膜中的多糖蛋白復合物進行測定，利用酶標儀讀取光密度值后求得多糖蛋白復合物的相對含量。生物被膜的形成不僅僅與自身的遺傳因素有關，各種培養條件對細菌生物被膜胞外多糖分泌量的影響也表現出不同的結果，這也充分證實了環境條件對其也起著重要的作用。

3 小結

綜上所述，上述方法尤其是FDA試驗和Re-sazurin試驗能夠替代傳統的瓊脂平板計數法，而且大多數的方法簡便，易行，能夠對微孔板生物被膜進行定量研究，是高通量的研究方法，具有較好的重復性和適用性，能夠實現試驗樣品的高通量操作對生物被膜生物量的測定。

大多數細菌均能夠形成生物被膜來抵抗外界環境條件的改變，同時逃避機體的免疫系統清除作用。從而造成致病力的增強、持續性感染的遷延不愈和耐藥性的廣泛傳播。在獸醫領域，大腸桿菌的耐藥性已成為畜牧業生產中的一個重要難題，相關報道顯示不同來源的大腸桿菌均表現出不同程度的耐藥性，其耐藥性的發展與生物被膜的形成也有一定相關性。更為嚴重的是，生物被膜的形成還會帶來一系列問題，包括在醫學領域（例如持久性和經常性的感染）和非醫學領域（例如飲用水和食品加工領域的防腐處理等）。因此，無論是在醫學領域還是獸醫領域，為了防止和治療細菌生物被膜引起的感染和耐藥性，必須對細菌生物被膜的病原和形成條件進行深入分析和了解，以便正確合理地選擇敏感抗菌藥物和生物被膜清除劑，防止細菌生物被膜造成的持續性感染和遷延不愈造成不必要的經濟損失。