青年人胃癌中Cathepsin B的表達及意義

何琳莉，文　彬,蹇順海

(川北醫學院，四川 南充　637000)

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青年人胃癌中Cathepsin B的表達及意義

何琳莉，文彬,蹇順海

(川北醫學院，四川 南充637000)

摘要：檢測了Cathepsin B在青年人胃癌組織中的表達，探討其與腫瘤發生機制的關系。采用免疫組化方法(S-P法)及原位雜交法檢測Cathepsin B蛋白及其mRNA在52例青年人胃癌組織、15例胃高級別上皮內瘤變組織及15例癌旁組織中的表達；分析Cathepsin B的表達與患者臨床病理特征的關系。結果表明：青年人胃癌中Cathepsin B陽性表達率顯著高于胃高級別上皮內瘤變(P<0.05)，癌旁組織不表達，且有淋巴結轉移及遠處轉移的患者表達增高(P<0.05)；Cathespin B mRNA在胃癌中高表達，非癌組織中幾乎不表達，與蛋白表達基本一致。說明Cathepsin B的高表達在青年人胃癌發生、發展過程中起重要作用，其表達水平可能成為提示胃癌轉移的良好指標。

關鍵詞：青年人胃癌；免疫組織化學；原位雜交

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發病率以及死亡率位居我國各種惡性腫瘤之首[1]。近年來，胃癌的發病規律有所變化，青年人(年齡≤35歲)胃癌的發病率呈上升趨勢[2]。大量研究表明：青年人胃癌具有更強的侵襲及轉移能力，而胃癌的預后與胃癌分化、浸潤及轉移密切相關[3-4]。

組織蛋白酶B屬于半胱氨酸蛋白酶，主要存在于胞漿溶酶體中，可降解多種細胞外基質，維持細胞內外蛋白水解的平衡。目前多數研究認為高表達的Cathepsin B與腫瘤的惡性進展關系密切[5]。在膀胱癌、肺癌、口腔癌、胰腺癌等惡性腫瘤中檢測到Cathepsin B表達增強，且與腫瘤的轉移密切相關[6-8]。目前在胃癌與Cathepsin B表達的相關性方面的研究較少。本文采用免疫組化及原位雜交法檢測青年人胃癌組織中Cathepsin B蛋白及其mRNA的表達，并結合患者臨床病理參數探討其在胃癌發生、發展過程中的作用。

1材料與方法

1.1標本

收集2003—2013年川北醫學院附屬醫院病理科確診存檔的青年人胃腺癌標本52例(患者年齡≤35歲，參照國內多數文獻報道對病人年齡段分組納入本研究)，將15例胃高級別上皮內瘤變組織及15例癌旁組織作為對照組。癌旁組織均含有胃黏膜，經HE染色確診胃黏膜上皮細胞形態正常，無癌細胞累及。

1.2主要試劑及抗體

Cathepsin B兔抗人單克隆抗體購自美國epitomics公司；Cathepsin B原位雜交試劑盒購自武漢博士德公司；二步法即用型檢測試劑及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術開發公司。

1.3免疫組化

采用EnVision兩步法檢測Cathepsin B蛋白的表達情況。所用石蠟塊組織均經連續切片、常規脫蠟、水化、抗原修復、滅活內源性過氧化物酶、滴加一抗、滴加二抗、DAB顯色、蘇木素復染、脫水、透明處理、封片等步驟。結果判定：cathepsin B表達部位主要位于癌細胞胞漿，部分位于細胞核內。使用DAB顯色系統染色，陽性結果為細胞漿內彌漫分布染色明顯的棕黃色顆粒。在光學顯微鏡下觀察(隨機選取5個高倍視野)，根據陽性細胞的染色強度及百分率計分[9]，其中：染色陽性細胞百分率小于5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，50%～75%為3分，大于75%為4分；細胞基本無著色為0分，細胞為淺黃色為1分，細胞為棕黃色為2分，細胞為棕色為3分。陽性程度按照上述兩項的乘積判定：0分記錄為陰性(-)，1～4分記錄為弱陽性(+)，5～8分記錄為中度陽性(++)，9～12分記錄為強陽性(+++)。

1.4原位雜交

石蠟切片常規脫蠟至水、3%過氧化氫滅活(10 min)、3%胃蛋白酶消化(10 min)、0.1 MPBS緩沖液后固定、滴加預雜交液、電熱恒溫箱42 ℃孵育(3 h)、滴加雜交液、電熱恒溫箱42 ℃孵育(24 h)、SSC緩沖液洗滌切片、滴加封閉液、滴加ISH(1 h)、電熱恒溫箱42 ℃孵育(1 h)、DAB顯色(10 min)、蘇木素復染(5 min)、酒精脫水(15 min)、封片。結果判定：使用POD/DAB顯色系統，陽性信號呈棕黃色，主要位于細胞漿，少數細胞核著色。隨機選取5個高倍視野(每個視野細胞數量大于200)，將陽性細胞數大于等于5定為陽性。

1.5統計學分析

應用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，各組間比較采用χ2檢驗。

2結果

2.1不同胃組織中Cathepsin B蛋白的表達

Cathepsin B蛋白定位于細胞漿，在癌旁組織、胃高級別上皮內瘤變組織及胃癌組織中的陽性率分別為0，13.3%，59.6%(圖1)。Cathepsin B在癌旁組織中無表達，在胃高級別上皮內瘤變組織中有2例表達。在胃癌組織中的陽性表達率與胃高級別上皮內瘤變組織相比顯著增高，且染色強度明顯加強，差異具有顯著性(P<0.01，見表1)。

圖1　Cathepsin B蛋白的表達

組別nCathepsinB-++++++癌旁組織1515000胃高級別上皮內瘤變組織1513110胃癌組織522161114

2.2胃癌中Cathepsin B蛋白的表達與臨床病理參數的關系

Cathepsin B蛋白在淋巴結有、無轉移組的陽性率分別為72.4%,43.5%；有、無遠處轉移組的陽性率分別為90.9%,51.2%；浸潤深度組中，T3—T4期、T1—T2期的陽性率分別為70.2%,33.3%。統計結果顯示:Cathepsin B蛋白的表達與胃癌浸潤深度、淋巴結轉移及遠處轉移有關(P<0.05)，但與患者性別、分化程度、腫塊大小、臨床分期無明顯相關性(P>0.05)。具體情況見表2。

表2　Cathepsin B蛋白表達與臨床病理參數的關系

2.3不同胃組織中Cathepsin B mRNA的表達

Cathepsin B mRNA陽性信號位于細胞漿。在癌旁組織、胃高級別上皮內瘤變組織及胃癌組織中的陽性率分別為0，6.7%，51.9%(見圖2)。Cathepsin B mRNA 在癌旁組織中無表達，在胃高級別上皮內瘤變組織中僅有1例微弱表達。胃癌中的陽性表達率顯著高于胃高級別上皮內瘤變組織(P<0.01)，與蛋白表達基本一致(見表3)。

圖2　Cathepsin B mRNA的表達

組別nCathepsinB-++++++癌旁組織1515000胃高級別上皮內瘤變組織1514100胃癌組織522551012

3討論

浸潤、轉移是惡性腫瘤的特征性表現，也是多數實質性惡性腫瘤難以治愈的原因。胃癌與其他惡性腫瘤一樣，其侵襲轉移是涉及多因素、多階段的連續動態過程。其中，基底膜成分的降解與腫瘤的惡性進展關系極為密切[10]。在這復雜的病理生理過程中，腫瘤細胞與其周圍的基質細胞可分泌多種酶降解細胞外基質，促使腫瘤細胞浸潤、轉移。Cathepsin B屬于半胱氨酸蛋白酶類，是一類主要存在于溶酶體中的胞內蛋白酶，其家族成員包括數十種亞型，如B、K、L、M、N、H等，目前研究較為多見的是B、L、D型。在生理狀態下，Cathepsin B可發揮降解多種蛋白質的重要作用，維持細胞內外蛋白水解的平衡。而在病理狀態下，Cathepsin B能水解多種細胞外基質成分，如IV型膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白等，參與腫瘤的浸潤、轉移[11]。目前，在多種實體惡性腫瘤中可檢測到Cathepsin B的高表達[12-14]。Ma等[15]研究發現：Cathepsin B在正常人食管黏膜無表達，而在食管癌及食管癌前病變中表達增高，并且在食管鱗癌裸鼠移植瘤模型中發現Cathepsin B高表達。在宮內膜癌的研究中發現[16]：Cathepsin B在宮內膜癌中的陽性率顯著高于正常宮內膜，且在抑制宮內膜癌細胞株中Cathepsin B基因后癌細胞增殖能力顯著降低。在另一項關于胃癌的研究中發現[17]：Cathepsin B在胃癌中活性顯著增高是其獨有的惡性表現，可能與腫瘤進展相關。Ebert 等[18]實驗發現：Cathepsin B在胃癌組織中的陽性表達率為98%，在胃癌患者血清中的陽性率顯著高于健康對照組(P<0.01)，有遠處轉移者血清水平明顯增高(P<0.05)，且Cathepsin B 血清水平高于129 pmol/L的患者生存率降低(P<0.05)，表明Cathepsin B可以作為胃癌診斷中判斷患者預后的潛力指標。但Czyzewska等[19]研究認為：Cathepsin B表達水平僅與患者淋巴結轉移有關，與患者5年生存率無相關性，因此Cathepsin B不能作為提示胃癌患者預后的獨立因素。

本文用青年人胃癌標本、胃高級別上皮內瘤變組織、癌旁組織研究Cathepsin B蛋白及mRNA的表達。結果顯示：Cathepsin B蛋白及mRNA在癌旁組織均無表達；在胃癌組織中，無論是蛋白陽性表達率、表達強度或是 mRNA陽性表達率及表達強度均顯著高于胃高級別上皮內瘤變組織，說明Cathepsin B表達增加可能是胃癌發生、發展的重要基礎。在本次實驗中，mRNA表達總體陽性率低于蛋白表達陽性率，但其結果分析與前者基本一致，這可能與檢測手段的敏感性不同有關。有報道指出，Cathepsin B在多種腫瘤浸潤邊緣處有表達增強的情況發生[20-21]。本研究發現其在胃癌組織的良-惡性分界處表達明顯，這可能與Cathepsin B參與腫瘤細胞對周圍組織的粘附及對細胞外基質屏障的降解有關。此外，在有淋巴結轉移組、遠處臟器轉移組及浸潤漿膜層組中均出現Cathepsin B蛋白的表達增加，提示Cathepsin B有可能成為判斷胃癌惡性程度、提示高轉移風險的生物學指標之一。

綜合以上分析， Cathepsin B在癌旁組織無表達，在青年人胃癌組織中高表達，且與淋巴結轉移等臨床病理參數有關。提示Cathepsin B與青年人胃癌發生、發展密切相關，有可能成為診斷胃癌的有效指標之一，且為胃癌的靶向治療提供新的思路，具有廣泛的研究前景。

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(責任編輯何杰玲)

Expression of Cathepsin B and Its Significance in Gastric Cancer Tissue of Young Patient

HE Lin-li, WEN Bin, JIAN Shun-hai

(North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, China)

Abstract:Cathepsin B expression in gastric cancer tissue in young people was detected and its relationship with the tumorigenesis mechanism was explored. The immunocytochemistry method (S-P method) and in-situ hybridization method were adopted to detect Cathepsin B and the expression of mRNA in 52 cases of gastric cancer tissues, 15 cases of gastric bypass high-grade intraepithelial neoplasia and 15 cases of cancer tissues. The positive rate of Cathepsin B in the gastric cancer tissue of non-selected people significantly exceeds non-typical gastric proliferating tissue, and there is no expression of normal appearing tissue(P<0.05). And there is a rise of expression among lymphatic metastasis and distant metastasis among young patients(P<0.05). The high expression of cathespin B mRNA in stomach cancer and the no expression in non-cancer tissue, which is in accord with the expression of protein. The high expression of Cathepsin B in gastric cancer occurrence and development plays an important role in the process and its expression level may be prompted a good index of the gastric cancer metastasis.

Key words:young patients with gastric cancer; immunocytochemistry; in-situ hybridization

中圖分類號：R735.2

文獻標識碼：A 1674-8425(2016)03-0069-05

doi:10.3969/j.issn.1674-8425(z).2016.03.012

作者簡介：何琳莉(1989—)，女，四川南充人，碩士，主要從事消化道腫瘤的基礎與臨床研究。

收稿日期：2015-12-12

引用格式：何琳莉，文彬,蹇順海.青年人胃癌中Cathepsin B的表達及意義[J].重慶理工大學學報(自然科學)，2016(3):69-73.

Citation format：HE Lin-li, WEN Bin, JIAN Shun-hai.Expression of Cathepsin B and Its Significance in Gastric Cancer Tissue of Young Patient[J].Journal of Chongqing University of Technology(Natural Science)，2016(3):69-73.