耐甲氧西林金黃色葡萄球菌對萬古霉素敏感性的研究

趙　娜, 賀恒鵬, 周　霞

(中國醫科大學附屬第四醫院 檢驗科, 遼寧 沈陽, 110032)

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耐甲氧西林金黃色葡萄球菌對萬古霉素敏感性的研究

趙娜, 賀恒鵬, 周霞

(中國醫科大學附屬第四醫院 檢驗科, 遼寧 沈陽, 110032)

摘要:目的探討耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)對萬古霉素的敏感性。方法取2007—2014年醫院分離的MRSA102株，采用瓊脂稀釋法檢測萬古霉素對MRSA的最低抑菌濃度(MIC)，采用PCR方法進行SCCmec分型及相關基因檢測。結果2007—2014年萬古霉素對MRSA的MIC(90)分別為1、1、2、2、2、2、2、2 mg/L, MIC(50)分別為1、1、1、2、1、1、1、1 mg/L。SCCmecⅡ型的MIC(50)和MIC(90)都為2 mg/L, SCCmecⅢ型的MIC(50)和MIC(90)分別為1 mg/L和2 mg/L, SCCmec V型和Ⅳ型的MIC(50)和MIC(90)都為1 mg/L。結論2007—2014年萬古霉素對MRSA的最低抑菌濃度無顯著變化, SCCmecⅡ型和Ⅲ型MRSA對萬古霉素的敏感性低于SCCmec V型和Ⅳ型菌株。

關鍵詞:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌; 萬古霉素; 敏感性

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是金黃色葡萄球菌的一種，也是革蘭陽性球菌，是1961年英國學者Jevons發現的一種新型的耐青霉素酶的耐藥菌株[1]。MRSA的耐藥基因主要位于葡萄球菌盒式染色體mec(SCCmec)上，根據mecA基因組分的差異，大致將SCCmec分成5種不同的類型(I～V型)[2]。近年來，MRSA在金黃色葡萄球菌感染中所占的比例逐年提高，感染程度越來越嚴重，已成為醫院及社區感染的重要病原菌之一[3]。Boucher等[4]研究顯示，美國MRSA感染每年造成約19 000人死亡，MRSA 感染已經與乙型肝炎、AIDS同為世界3大感染性疾病[5]。本研究探討MRSA對萬古霉素的敏感性，現報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

2007—2014年醫院臨床標本中分離的102株MRSA菌株。購于中國藥品生物制品檢定所的金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC29213。由中國藥品生物制品檢定所生產的萬古霉素藥粉，有效期內使用。賽默飛世爾生物化學制品有限公司生產的BHI干粉培養基。

1.2方法

1.2.1萬古霉素選擇性培養基的配制：稱取47 g BHI瓊脂，溶解于900 mL蒸餾水，經高壓滅菌，冷卻至45～50 ℃，在每個平皿中加入2 mL 2.5 mg/L萬古霉素溶液，再倒入約18 mL的瓊脂溶液充分混勻，即配制成0.25 mg/L的萬古霉素選擇性培養基。同法，分別加入不同濃度的萬古霉素即可配制成0.5、1、2、4和8 mg/L的萬古霉素培養基。待瓊脂凝固后立即裝入密閉塑料袋中，放入2～8 ℃冰箱保存，5 d內使用。

1.2.2MRSA的最低抑菌濃度的檢測：將MRSA凍存菌株接種于血平板復活，并轉種2代，然后用無菌生理鹽水配制成0.5麥氏管(細菌濃度相當于108CFU/mL)，稀釋至107CFU/mL, 取1 μL分別接種于0.25、0.5、1、2、4和8 mg/L的萬古霉素選擇性培養基，35℃孵育，觀察細菌生長情況，以完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為最小抑菌濃度(MIC)，抑制50%試驗菌的最低藥物濃度為MIC50，抑制90%試驗菌的最低藥物濃度為MIC90。同時參照CLSI-M100-S19-2009用標準菌株ATCC29213作為質量控制(MIC參考范圍為0.5～2 mg/L)。

1.2.3PCR方法進行SCCmec分型及相關基因檢測: ① PCR模板。采用細菌基因組提取試劑盒，嚴格按照操作說明提取基因組DNA。② PCR引物 由上海生工合成。③ PCR體系。上下游引物(20 pmol/μL)各0.5 μL，dNTP(2.5 mM) 2 μL，MgCl2(25 mM)1 μL，10X Buffer 2.5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，無菌純水加至25 μL。④ PCR循環參數。94 ℃變性5 min，94 ℃ 1 min、50℃ 2 min、72℃ 2 min，循環35次，最后72 ℃延長10 min。⑤ PCR產物電泳。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，紫外凝膠成像儀觀察是否出現目的條帶，并拍照成像。⑥ PCR產物測序。將PCR產物送上海生工生物技術公司純化并進行雙向測序。⑦ 序列分析。測序結果經bioedit軟件處理后，提交GenBank數據庫進行BLAST對比，明確其基因型。見表1。

表1　SCCmec分型及相關基因檢測

2結果

2.12007—2014年MRSA對萬古霉素的敏感性

標準菌株ATCC29213的MIC檢測結果為1 mg/L, 在參考范圍內。2007—2014年的萬古霉素對MRSA的最低抑菌濃度分布情況見表2。2007、2008年的MIC90為1 mg/L, 對萬古霉素的敏感性較高；2009—2014年MIC90上升為2 mg/L, 較2007、2008年升高；而MIC50值在8年中只有2010年稍微波動，其值為2 mg/L, 其余年份為1 mg/L, 可知2010年MRSA對萬古霉素敏感性較低。

2.2不同MecA基因型的MRSA對萬古霉素敏感情況

萬古霉素對各種基因型的MRSA的的最低抑菌濃度見表3。結果顯示CCmecⅡ型、Ⅲ型的MIC90均為2 mg/L，SCCmecV型和Ⅳ型的MIC90均為1 mg/L, SCCmecⅡ型、Ⅲ型的MRSA對萬古霉素敏感性低于SCCmecV型和Ⅳ型；只有SCCmecⅡ型MIC50為2 mg/L, 其余各型均為1 mg/L, SCCmecⅡ型的MRSA對萬古霉素敏感性最低。

表3　萬古霉素對Ⅱ型，Ⅲ型，Ⅳ型，V型MRSA的

3討論

MRSA感染的治療是目前臨床難題之一，其與很多難治性感染有關[6]，且MRSA所致感染發生率呈明顯上升趨勢，已成為醫院相關性感染的重要致病菌[7]。MRSA的基因分型中，SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型常攜帶多個耐藥基因(臨床表現對多種抗菌藥物耐藥)，多存在于醫院環境中；SCCmec Ⅳ、Ⅴ型體積較小，幾乎不攜帶其他耐藥基因(對大多抗菌藥物敏感)，且適應性強，易于在人群中傳播和定植，多見于社區環境，已成為社區獲得性MRSA的獨特標志。本實驗中，SCCmecⅡ型的MIC50、MIC90都為2 mg/L，SCCmecⅢ型的MIC50和MIC90分別為1 mg/L和2 mg/L, SCCmec V型和Ⅳ型的MIC50、MIC90都為1 mg/L。結果表明醫院獲得性的MRSA對萬古霉素的敏感性低于社區獲得性的MRSA，這可能與其攜帶多種毒素、毒力很強且適應性強有關。Moise-Broder等[8]研究發現，Ⅱ型MRSA易引起萬古霉素治療的失敗，本實驗中SCCmecⅡ型MRSA對萬古霉素敏感性也是最低的，與上述研究相符。

研究[9]發現萬古霉素對MRSA的最低抑菌濃度逐漸增高，而本實驗中MRSA對萬古霉素的敏感性逐年降低的趨勢不甚明顯，這可能與地區差異以及不同年份使用抗生素的情況有關。很多國外的研究都檢測出萬古霉素中介金黃色葡萄球菌以及耐萬古霉素金黃色葡萄球菌。因此，定期檢測MRSA，合理使用抗生素，對減緩耐萬古霉素MRSA出現具有重要的意義。

參考文獻

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[3]許文, 楊聯云. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌流行病學和耐藥機制研究進展[J]. 檢驗醫學與臨床, 2013, 10 (1): 75.

[4]BOUCHER HW, COREY GR. Epidemiology of methicillin-resistant staphylococcus aureus[J]. Clinical Infectious Diseases, 2008, 46 ( Suppl5): S344.

[5]陳迎曉, 黃瑜, 王曉東, 等. 醫院與社區獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的臨床特點和耐藥性的對比分析[J]. 中國全科醫學, 2013, 16 (1A): 93.

[6]程麗娟, 李曉燕. 金黃色葡萄球菌89株耐藥性分析[J]. 山西醫藥雜志, 2013, 42(2): 210.

[7]石峰, 吳田珠, 肖宇, 等. 不同劑量萬古霉素治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌所致腹膜透析相關性腹膜炎的效果研究[J]. 實用心腦肺血管病雜志, 2014, 22(10): 125.

[8]VANDENESCH F, NAIMI T, ENRIGHT M C, et al. Community-acquired methicillin-resistant staphylococcus aureus carrying Panton-Valentine leukocidin genes: worldwide emergence[J]. Emerg Infect Dis, 2003, 9(8): 978.

[9]MURRAY K P, ZHAO J J, DAVIS S L, 等. 治療萬古霉素最低抑菌濃度>1mg/L耐甲氧西林金黃色葡萄球菌血流感染早期改用達托霉素的配對隊列研究[J]. 中國感染與化療雜志, 2014, 14(6): 556.

Research on sensibility of meticillin-resistant staphylococcus aureus to vancomycin

ZHAO Na, HE Hengpeng, ZHOU Xia

(DepartmentofLaboratory,TheFourthAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang,Liaoning, 110032)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the sensibility of methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) to vancomycin. MethodsA total of 102 MRSA strains in hospital from 2007 to 2014 were collected. Agar dilution method was used to detect the minimum inhibitory concentration (MIC) of vancomycin to MRSA, and PCR was used to detect SCCmec classification and related gene. ResultsFrom 2007 to 2014, the values of MIC(90) of vancomycin to MRSA were 1, 1, 2, 2, 2, 2, 2 and 2 mg/L respectively, and the values of MIC(50) were 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1 and 1 mg/L respectively. Both MIC(90) and MIC(50 ) of SCCmec Ⅱ were 2 mg/L, MIC(90) and MIC(50 ) of SCCmec Ⅲ were 2 mg/L and 1 mg/L respectively, and MIC(90) and MIC(50 )of SCCmec Ⅳ and V were 1 mg/L. ConclusionThe MIC of vancomycin to MRSA in hospital dose not change obviously from 2007 to 2014. The sensibility of SCCmec Ⅱand SCCmec Ⅲ to vancomycin is lower than SCCmec Ⅳ and SCCmec V.

KEYWORDS:methicillin-resistant staphylococcus aureus; vancomycin; sensibility

中圖分類號:R 37

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)07-079-03

DOI:10.7619/jcmp.201607023

收稿日期:2015-11-20