硼替佐米對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制

孫紅生(勝利石油管理局河口醫(yī)院，山東東營257200)

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硼替佐米對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制

孫紅生(勝利石油管理局河口醫(yī)院，山東東營257200)

摘要：目的觀察硼替佐米對多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞凋亡的影響，探討其作用機(jī)制。方法將體外培養(yǎng)的MM細(xì)胞株RPMI8226隨機(jī)分組，分別加入20、40、80和160 nmol/L硼替佐米(硼替佐米組)，對照組未加藥物，處理24 h時(shí)收集各組細(xì)胞。采用Anexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡指數(shù)；采用Real-time PCR和Western blotting法分別檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果20、40、80、160 nmol/L硼替佐米作用24 h時(shí)細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為0.21±0.03、0.21±0.02、0.23±0.03、0.26±0.02，對照組分別為0.01±0.00，組間比較及各濃度間比較P均<0.05。硼替佐米組β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1 mRNA及蛋白表達(dá)均低于對照組(P均<0.01)；隨硼替佐米濃度升高，β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1 mRNA及蛋白表達(dá)逐漸降低(P均<0.01)。結(jié)論硼替佐米可誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡，抑制Wnt/β-catenin信號通路可能是其作用機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：多發(fā)性骨髓瘤；硼替佐米；Wnt/β-catenin信號通路；凋亡

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一類漿細(xì)胞異常惡性進(jìn)展性疾病[1]。目前治療MM最好的方法是異基因造血干細(xì)胞移植聯(lián)合反應(yīng)停及其衍生物化療，但完全緩解率不足10%，中位生存期僅3～4年，進(jìn)展期患者的中位生存期僅6個(gè)月[2]。硼替佐米是一種新型的蛋白酶抑制劑，是人工合成的丙氨酸基硼酸衍生物。臨床前研究證實(shí)，硼替佐米可以通過誘導(dǎo)多種血液腫瘤和實(shí)體腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，但其抗腫瘤作用的確切機(jī)制仍不明確[3,4]。2012年1月～2014年12月，本研究觀察了硼替佐米對MM細(xì)胞凋亡的影響，探討其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料MM細(xì)胞株RPMI8226購自美國模式菌種收集中心(ATCC)。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1和β-actin抗體均購自Santa Cruz公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自日本同仁化學(xué)研究所，Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)均購自寶生物工程(大連)有限公司。ECL發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理MM細(xì)胞株RPMI8226懸浮培養(yǎng)于含有90% RPMI1640、10%滅活FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 U/mL硫酸鏈霉素的培養(yǎng)基，置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，每48 h傳代1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞，隨機(jī)分組，分別加入20、40、80和160 nmol/L硼替佐米(硼替佐米組)，對照組未加藥物，每組設(shè)3個(gè)平行孔，處理24 h時(shí)收集各組細(xì)胞，用于后續(xù)研究。

1.3細(xì)胞凋亡處理24 h時(shí)收集各組細(xì)胞于1.5 mL EP管中，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌細(xì)胞。采用Anexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況，根據(jù)染色細(xì)胞數(shù)量除以總細(xì)胞數(shù)計(jì)算凋亡指數(shù)。

1.4β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1 mRNA表達(dá)處理24 h時(shí)收集各組細(xì)胞于1.5 mL離心管中，加入1 mL TRIzol，提取總RNA。按照RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書配制25 μL Real-time PCR反應(yīng)體系，于ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算β-catenin、Survivin、c-myc和Cyclin D1 mRNA的相對表達(dá)量。

根據(jù)NCBI Genbank上已公布的人β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1和β-actin基因的mRNA序列合成PCR引物[5]，所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。

1.5β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1蛋白表達(dá)處理24 h時(shí)收集各組細(xì)胞于1.5 mL離心管中，用含0.1% PMSF的預(yù)冷PBS洗滌2次，加入400 μL細(xì)胞裂解液于冰上靜置30 min，4 ℃下10 000 r/min離心30 min，取上清液，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度。取100 μg蛋白加入4×SDS-PAGE Loading buffer沸水中孵育10 min，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后切下目的蛋白凝膠于轉(zhuǎn)膜儀上轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入鼠抗人β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1和β-actin抗體孵育過夜， 利用ECL發(fā)光試劑盒顯影， 采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察、拍照，以對照組表達(dá)量為1，計(jì)算硼替佐米組各蛋白的相對表達(dá)量。

表1　各基因的引物序列

2結(jié)果

2.1細(xì)胞凋亡指數(shù)20、40、80、160 nmol/L硼替佐米作用24 h細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為0.21±0.03、0.21±0.02、0.23±0.03、0.26±0.02，對照組為0.01±0.00，組間比較及各濃度間比較P均<0.05。

2.2β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1 mRNA表達(dá)硼替佐米組β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1 mRNA表達(dá)均低于對照組(P均<0.01)；隨硼替佐米濃度增加，β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1 mRNA表達(dá)逐漸降低(P均<0.01)，且均低于對照組(P均<0.01)。見表2。

表2　　　　各組β-catenin、Survivin、c-myc、

注：組間及各濃度間比較，P均<0.01。

2.3β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1蛋白表達(dá)硼替佐米組β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1蛋白表達(dá)均低于對照組(P均<0.01)；隨硼替佐米濃度增加，β-catenin、Survivin、c-myc和Cyclin D1蛋白表達(dá)逐漸降低(P均<0.01)，且均低于對照組(P均<0.01)。見表3。

表3　　　　各組β-catenin、Survivin、c-myc、

注：組間及各濃度間比較，P均<0.01。

3討論

硼替佐米是一種雙肽基硼酸鹽類似物，是在蛋白質(zhì)降解的“泛素-蛋白酶體”通路理論基礎(chǔ)上研發(fā)的新型抗腫瘤藥物。硼替佐米作為全世界第一種人工合成的用于臨床的蛋白酶體競爭性抑制劑，可通過多種途徑發(fā)揮抗MM作用[6，7]。研究顯示，硼替佐米可促進(jìn)MM細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白NOXA和抑癌基因p53表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。硼替佐米通過Caspase-8依賴性Sp1蛋白質(zhì)激活Caspase通路，導(dǎo)致組蛋白去乙酰化酶基因家族Ⅰ表達(dá)下調(diào)，使組蛋白高度乙酰化，從而誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡[9]。目前，硼替佐米促凋亡作用與Wnt/β-catenin信號通路關(guān)系的報(bào)道較少。

Wnt/β-catenin信號通路是生物體內(nèi)一條重要的且極為保守的信號通路，參與細(xì)胞生長和胚胎發(fā)育，與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。在許多人類腫瘤組織和細(xì)胞中β-catenin呈異常表達(dá)，如在Wnt-1缺陷鼠腫瘤模型中可見乳腺原發(fā)癌和肺轉(zhuǎn)移灶消失；在鼻咽癌和食管鱗癌中，由于甲基化作用Wnt抑制因子1活性失活，Wnt通路異常激活，促進(jìn)腫瘤形成[10]；高遷移率組1(HMGA-1)是Wnt/β-catenin信號通路的下游基因。敲除HMGA-1基因顯著降低小鼠胃癌細(xì)胞增殖[11]；在胃和結(jié)腸良性腫瘤惡變形成的早期階段，Wnt-1抑制因子Sox17表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致Wnt活性增強(qiáng)，促進(jìn)胃和結(jié)腸惡性腫瘤進(jìn)展[12]；Wnt-1過表達(dá)與乙型與丙型肝炎相關(guān)性肝癌、非小細(xì)胞肺癌以及黑色素瘤與唾液腺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[13]。Wnt/β-catenin信號具有多種下游靶基因，包括調(diào)控細(xì)胞凋亡和壞死的基因，如β-catenin、Survivin、c-myc、Cyclin D1，一旦啟動這些基因，細(xì)胞將啟動凋亡或壞死程序。雖然目前對于Wnt/β-catenin信號通路對細(xì)胞凋亡和壞死的調(diào)控機(jī)制已有許多研究，但這些研究尚處于起步階段，還有許多未知機(jī)理等待發(fā)掘[14]。由于Wnt/β-catenin信號通路及其下游靶基因的異常變化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此抑制Wnt/β-catenin信號通路被認(rèn)為是理想的腫瘤治療策略[15]。

本研究中，20、40、80、160 nmol/L硼替佐米處理24 h，RPMI8226細(xì)胞凋亡指數(shù)逐漸增加，Wnt/β-catenin信號通路標(biāo)志蛋白β-catenin、Survivin、c-myc和Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)均逐漸降低，且具有劑量依賴性；提示抑制Wnt/β-catenin信號通路可能是硼替佐米誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一，但其確切作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

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(收稿日期：2016-01-28)

中圖分類號：R733.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)12-0033-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.010