厄貝沙坦聯合骨化三醇對糖尿病腎病大鼠腎功能及TGF-β1、CTGF表達的影響

徐園園，魏迎鳳，盧學超，解其華，翟林云 (南通市第三人民醫院，南通226000)

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厄貝沙坦聯合骨化三醇對糖尿病腎病大鼠腎功能及TGF-β1、CTGF表達的影響

徐園園，魏迎鳳，盧學超，解其華，翟林云 (南通市第三人民醫院，南通226000)

摘要：目的探討聯合應用厄貝沙坦及骨化三醇對糖尿病腎病(DN)大鼠腎功能及腎組織轉化生長因子β1(TGF-β1)、結締組織生長因子(CTGF)表達的影響。方法將40只雄性大鼠隨機分為正常對照組、DN組、厄貝沙坦組、骨化三醇組及聯合治療組各8只。除正常對照組外，其余各組均采用腹腔注射鏈脲佐菌素的方法建立DN模型。骨化三醇組予骨化三醇溶于0.05 mL花生油，以 0.03 μg/(kg·d)灌胃；厄貝沙坦組予厄貝沙坦50 mg/(kg·d)及等量花生油灌胃；聯合治療組予骨化三醇0.03 μg/(kg·d)及厄貝沙坦50 mg/(kg·d)灌胃。DN組、正常對照組予等量花生油灌胃。各組均連續用藥8周。8周后檢測各組大鼠24 h尿白蛋白定量(24 h UTP)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)；取腎臟行HE染色，光鏡下觀察各組腎臟病理學改變；免疫組化法檢測各組腎組織TGF-β1、CTGF蛋白的表達。結果與厄貝沙坦組、骨化三醇組相比，聯合治療組24 h UTP、BUN、Scr均降低，腎功能病理改變減輕，腎組織TGF-β1、CTGF蛋白表達降低(P<0.05)。結論厄貝沙坦聯合骨化三醇對DN大鼠具有保護腎功能、減輕腎組織纖維化等作用，其機制可能與降低腎組織TGF-β1、CTGF蛋白表達有關。

關鍵詞：糖尿病腎病；厄貝沙坦；骨化三醇；轉化生長因子β1；結締組織生長因子

糖尿病腎病(DN)是糖尿病微血管并發癥之一，其發病機制目前尚未完全明確。研究表明，高糖介導的腎素-血管緊張素(RAS)系統過度激活是導致DN進展的主要因素[1]。RAS系統激活可誘導轉化生長因子β1(TGF-β1)及其相關因子的過度表達，從而介導腎小球的肥大及纖維化。血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素受體阻滯劑(ARB)可抑制RAS系統激活，已廣泛應用于DN的治療中。然而，由于ACEI及ARB可使腎素的反饋抑制中斷，引起腎素的代償性增加，降低藥物療效，因此DN的治療仍有待其他藥物的干預[2]。近期研究證實，活性維生素D3可通過多種機制保護腎臟的作用[3]。骨化三醇是一種活性維生素D3。2014年8～12月，我們將厄貝沙坦聯合骨化三醇用于治療DN，觀察患者腎功能及腎組織TGF-β1、結締組織生長因子(CTGF)表達的變化，探討兩組藥物聯和應用治療DN的療效。

1材料與方法

1.1動物及試劑健康雄性SD大鼠40只，清潔級，體質量(260±20)g，由南通大學實驗動物中心提供。骨化三醇膠丸購自上海羅氏制藥有限公司；厄貝沙坦片購自賽諾菲杭州制藥有限公司；鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體購自美國Abcam 公司；兔抗大鼠CTGF多克隆抗體購自美國Abcam 公司；即用型SABC-POD(兔IgG)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2模型制備及分組大鼠適應性喂養1周后，隨機選取32只大鼠，禁食12 h，于左下腹一次性注射STZ 60 mg/kg制備DN模型。72 h后尾靜脈取血測定血糖，收集24 h尿量，以血糖濃度≥16.7 mmoL/L、尿量>原尿量150%、24 h尿蛋白排泄率>30 mg為DN造模成功。其余8只作為正常對照組，左下腹注射同體積的枸櫞酸鉀緩沖液。將DN大鼠隨機分為骨化三醇組、厄貝沙坦組、聯合治療組、DN組，每組各8只。骨化三醇組予骨化三醇溶于0.05 mL花生油，以 0.03 μg/(kg·d)灌胃；厄貝沙坦組予厄貝沙坦50 mg/(kg·d)及等量花生油灌胃；聯合治療組予骨化三醇0.03 μg/(kg·d)及厄貝沙坦50 mg/(kg·d)灌胃。DN組、正常對照組予等量花生油灌胃。各組均連續用藥8周。

1.3腎功能指標測定

1.3.124 h尿白蛋白定量(24 h UTP)測定于造模后第8周末處死大鼠前1天，禁食不禁水，收集各組24 h尿液，采用雙縮脲法測定24 h UTP。

1.3.2動脈血尿素氨(BUN)、血肌酐(Scr)水平檢測于造模后第8周末處死大鼠前1天腹主動脈采血，采用全自動多功能生化分析儀測定血BUN、Scr水平。

1.4腎臟病理組織觀察于造模后第8周末處死各組大鼠，留取腎組織，4%甲醛固定，石蠟包埋，切片行HE染色，光鏡下觀察各組腎組織病理改變。

1.5腎組織TGF-β1、CTGF蛋白表達采用免疫組化法。一抗分別為兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體及兔抗大鼠CTGF多克隆抗體，嚴格按照說明書操作。400倍高倍鏡視野下觀察陽性細胞表達情況，TGF-β1與CTGF陽性為細胞質呈棕黃色顆粒狀。每張切片隨機選取10個區域，采用Mias-2000圖像分析系統測定陽性細胞的積分光密度。

2結果

2.1各組腎功能指標比較厄貝沙坦組、骨化三醇組、聯合治療組24 h UTP、BUN、Scr均低于DN組(P均<0.05)，聯合治療組24 h UTP、BUN、Scr均低于厄貝沙坦組、骨化三醇組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組腎功能指標比較

注：與正常對照組比較，#P<0.05；與DN組比較，*P<0.05；與厄貝沙坦組比較，△P<0.05。

2.2各組腎臟病理改變DN組腎小球體積增大，腎小球系膜基質增寬，系膜擴張，基底膜增厚，腎小球毛細血管腔受壓變窄，部分腎小球硬化，并有炎性細胞浸潤，腎小管擴張或灶性萎縮，并有大量炎性細胞浸潤;骨化三醇組、厄貝沙坦組及聯合治療組大鼠的上述病變均有不同程度的減輕，表現為腎小球體積減小，系膜增生改善，炎性細胞浸潤減少，其中以聯合治療組最為明顯。

2.3各組腎組織TGF-β1、CTGF蛋白表達情況光鏡下，正常對照組大鼠腎組織中有極少量的TGF-β1、CTGF表達，DN組TGF-β1、CTGF在腎小球上皮細胞及系膜區、毛細血管袢、腎小管上皮細胞及間質細胞均有表達，骨化三醇組、厄貝沙坦組及聯合治療組腎組織TGF-β1、CTGF表達均有不同程度減少，其中以聯合治療組最為明顯。各組腎組織TGF-β1、CTGF蛋白表達比較見表2。

表2 　　　　各組腎組織TGF-β1、CTGF蛋白表達

注：與正常對照組比較，#P<0.05；與DN組比較，*P<0.05；與厄貝沙坦組比較，△P<0.05。

3討論

DN早期表現為微量白蛋白尿，如不積極干預，可逐漸進展為嚴重的蛋白尿，最終導致終末期腎病[4]。DN發病機制復雜，目前尚未闡明，其中RAS系統的激活在腎損傷病變中具有重要作用。DN發生時可激活RAS系統，使血管緊張素Ⅱ增加，誘導TGF-β1的過度表達，導致腎小球肥大、增生，成纖維細胞形成及增殖，增加細胞外基質(ECM)的合成，抑制ECM降解，最終導致腎臟纖維化[5]。

目前，臨床上抗RAS系統的藥物主要為ACEI和ARB，已廣泛應用于DN的臨床治療。這兩類藥物可減少血管緊張素Ⅱ的產生，降低腎小球內壓力，減少細胞外基質的積聚，防止腎小球硬化，延緩腎組織纖維化進展。厄貝沙坦是ARB類藥物，可以阻斷血管緊張素Ⅱ的作用，降低腎小球內壓，改善腎血流動力學，使尿蛋白排泄量下降，從而起到保護腎臟的作用[6]。但抗RAS系統的藥物也可引起腎素水平升高，從而限制了藥物的治療效果。雖然抗RAS系統的藥物在延緩DN進展方面起到一定的效果，但大部分患者的腎功能仍在以一定的速度不斷降低，故延緩DN的進展仍需其他藥物的干預。

近年研究發現，活性維生素D3及其類似物除了經典的作用外，對腎小球損傷也有保護作用。國外有學者研究發現，在體外培養大鼠和人的腎臟系膜細胞，在培養液中加入活性維生素D3，結果發現系膜細胞增殖減少，尿蛋白排泄下降[7]。亦有研究發現，使用活性維生素D3干預腎炎大鼠模型，可增加足細胞突質膜上的寡聚體數量，對足細胞起到保護作用，從而減輕腎臟病變[8]?？梢?，應用活性維生素D3治療DN大鼠可改善腎小球濾過屏障功能，減輕炎癥反應，減少足細胞損傷，降低蛋白尿，并且可以減少TGF-β1等細胞因子表達，從而延緩腎小球硬化[9,10]。本研究發現，厄貝沙坦組、骨化三醇組及聯合治療組24 h UTP、BUN、Scr均降低，且聯合治療組低于厄沙坦組及骨化三醇組，聯合治療組腎臟病理改變均減輕，提示骨化三醇可協同厄貝沙坦更好地發揮減少尿蛋白、減輕腎小球及腎間質纖維化等作用，從而保護腎功能、延緩DN的病變。

TGF-β1是最重要的致纖維化細胞因子[11]。CTGF是近年來發現的致纖維化因子。Tall等[12]研究證實，TGF-β1可誘導CTGF的表達，而CTGF作為TGF-β1發揮生物學活性的下游介質，可介導其發揮促纖維化作用。楊燁等[13]研究發現，TGF-β1表達水平越高，腎臟病變越嚴重，且活性維生素D3可通過TGF-β1途徑保護腎臟。因此，抑制TGF-β1、CTGF被認為是治療腎臟纖維化疾病的有效方法。本研究結果顯示，DN組腎組織TGF-β1、CTGF表達均較正常對照組升高，腎臟病理表現為腎小球肥大、ECM積聚等腎臟纖維化改變，提示DN的發生可能與TGF-β1和CTGF的過度表達誘導腎臟纖維化有關[14]；與厄貝沙坦組、骨化三醇組相比，聯合治療組腎組織TGF-β1、CTGF蛋白表達降低，提示厄貝沙坦與骨化三醇聯合治療可進一步降低TGF-β1、CTGF蛋白的表達，從而延緩腎臟纖維化，改善DN病變的進展。

綜上所述，厄貝沙坦聯合骨化三醇具有保護腎功能、減輕腎組織纖維化、延緩DN進展等作用，其機制可能與降低腎組織TGF-β1、CTGF蛋白的表達有關。

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(收稿日期：2015-10-26)

中圖分類號：R587.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)14-0033-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.011

基金項目：江蘇省南通市衛生局青年科研基金項目(WQ2014029)。