應(yīng)用PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因

彭亦平 宗佩蘭 辛茶香 熊國(guó)亮 胡群芳 袁小蘭 史安良 姚琳 王小路 萬(wàn)贊燕 吳娟

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·論著·

應(yīng)用PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因

彭亦平 宗佩蘭 辛茶香 熊國(guó)亮 胡群芳 袁小蘭 史安良 姚琳 王小路 萬(wàn)贊燕 吳娟

目的 評(píng)價(jià)PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因中的應(yīng)用價(jià)值。方法 選取2014年8月至2015年12月江西省胸科醫(yī)院住院的部分肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，共1071例。研究對(duì)象均送檢了痰液標(biāo)本，共1071份。所有患者均經(jīng)病原學(xué)或病理學(xué)證實(shí)，或符合菌陰肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)。采用PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)研究對(duì)象痰標(biāo)本進(jìn)行異煙肼(H)、利福平(R)、鏈霉素(S)、乙胺丁醇(E)耐藥基因檢測(cè)，并以痰培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本的藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)檢測(cè)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的可靠性及評(píng)價(jià)其檢測(cè)效能。結(jié)果 PCR-反向點(diǎn)雜交檢測(cè)的1071例患者中，596例結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率為55.65%。其中，218例(36.58%)檢出H、R、S、E耐藥基因突變，分布于所測(cè)13個(gè)位點(diǎn)。H、R、S、E最常見(jiàn)突變位點(diǎn)分別位于KatG的315M(82.53%，137/166)、rpoB的S531L(69.50%，98/141)、rpsl的43M(78.65%，70/89)、embB的306M2(55.13%，43/78)和306M1(39.74%，31/78)。433例患者標(biāo)本同時(shí)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽(yáng)性且同時(shí)PCR-反向點(diǎn)雜交檢測(cè)陽(yáng)性157例。以培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，PCR-反向點(diǎn)雜交法對(duì)H、R、S、E的耐藥檢測(cè)經(jīng)Kappa檢驗(yàn)具有較好的一致性(Kappa值分別為0.77、0.73、0.66、0.49)；敏感度分別為88.89%(40/45)、79.66%(47/59)、67.57%(25/37)、63.16%(12/19)；特異度分別為91.07%(102/112)、91.84%(90/98)、95.00%(114/120)、91.30%(126/138)。結(jié)論 PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)較為可靠，對(duì)早期臨床用藥具有較好的指導(dǎo)作用。

聚合酶鏈反應(yīng)； 分枝桿菌，結(jié)核； 抗藥性，細(xì)菌； 基因

PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)是將PCR技術(shù)的高敏感度、反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)的高特異性和膜芯片技術(shù)的高通量3種成熟技術(shù)的優(yōu)勢(shì)有效結(jié)合的快速基因診斷手段。它可同時(shí)檢測(cè)4種一線藥物的5個(gè)常見(jiàn)耐藥相關(guān)基因上13個(gè)位點(diǎn)的突變，且簡(jiǎn)便快速，可直接采用痰標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，8 h即可得出結(jié)果。本研究采用PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)，對(duì)江西省胸科醫(yī)院住院肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行一線抗結(jié)核藥物[異煙肼(H)、利福平(R)、鏈霉素(S)、乙胺丁醇(E)]的5個(gè)常見(jiàn)耐藥突變基因中的13個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，以了解這些基因突變的發(fā)生頻率及分布特點(diǎn)，并以藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)作為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，分析其敏感度、特異度、符合率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值等指標(biāo)，評(píng)價(jià)其在結(jié)核分枝桿菌快速耐藥檢測(cè)中的價(jià)值。

對(duì)象和方法

1.對(duì)象：選取2014年8月至2015年12月江西省胸科醫(yī)院住院的部分肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，共1071例。其中，男723例，女348例，年齡19～85歲。研究對(duì)象均送檢了痰液標(biāo)本，共1071份。所有患者均經(jīng)病原學(xué)或病理學(xué)證實(shí)，或符合菌陰肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.儀器與試劑：DA7600基因擴(kuò)增儀由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供；HR40-ⅡA2生物安全柜由青島海爾公司提供；恒溫雜交儀由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供；PCR-反向點(diǎn)雜交試劑由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供；分離培養(yǎng)專用酸性羅氏培養(yǎng)基由江西省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)室自制。

3.PCR-反向點(diǎn)雜交：(1)DNA提取及PCR擴(kuò)增：取痰標(biāo)本3～5 ml，加等量4%NaOH液化20 min，離心半徑5 cm，13 000 r/min，離心5 min，棄上清；向沉淀中加入1 ml的磷酸鹽緩沖液，混勻，離心半徑5 cm，10 000 r/min，離心2 min；向沉淀中加入50 μl裂解液，打勻，沸水浴10 min，離心半徑5 cm，10 000 r/min，離心2 min，留上清液。取出PCR反應(yīng)管，在管壁上做好標(biāo)記，離心半徑5 cm，5000 r/min，離心10 s，加入已提取的待測(cè)樣品DNA 4 μl。同時(shí)取兩管PCR反應(yīng)管分別加入陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品DNA，作為產(chǎn)品使用過(guò)程的質(zhì)量控制。按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行擴(kuò)增。(2)雜交、洗膜、顯示：取15 ml塑料離心管，放入標(biāo)有患者編號(hào)的膜條，加入AT液(依說(shuō)明書(shū)，由氯化鈉、檸檬酸鈉、十二烷基硫酸鈉按一定比例配置) 5～6 ml及所有(25 μl)PCR 產(chǎn)物，將蓋擰緊，混勻。將離心管放入沸水浴中加熱10 min，取出離心管，放入分子雜交箱59 ℃雜交1.5 h。取50 ml塑料管，加入40 ml B液(依說(shuō)明書(shū)，由氯化鈉、檸檬酸鈉按一定比例配置)于分子雜交箱或水浴箱中預(yù)熱至59 ℃。取出膜條，移至裝有預(yù)熱至59 ℃ B液的50 ml管中，于59 ℃輕搖洗滌15 min。按AT液∶POD(鏈霉親和素辣根過(guò)氧化物酶)=2000∶1配制孵育液，室溫輕搖孵育30 min，棄去POD 溶液。用AT 液室溫輕搖洗2次，每次5 min。用C 液(檸檬酸鈉)室溫洗膜2 min，同時(shí)配制顯色液。將膜條浸泡于顯色液中避光顯色5～10 min即可觀察結(jié)果。

4.細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)：按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[1],采用改良羅氏培養(yǎng)法及比例法藥敏試驗(yàn)。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，PCR-反向點(diǎn)雜交檢測(cè)與藥敏試驗(yàn)對(duì)研究對(duì)象耐藥檢測(cè)結(jié)果的比較采用McNemar檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)PCR-反向點(diǎn)雜交檢測(cè)與藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa值≥0.75為兩者的一致性較好，Kappa值為0.4～0.75為一致性一般，Kappa值<0.4為一致性差。符合率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/檢測(cè)對(duì)象總例數(shù)×100%；敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。

結(jié) 果

1.PCR-反向點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果：1071例患者中，596例結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率為55.65%。其中，378例(63.42%)未檢出H、R、S、E耐藥基因突變，218例(36.58%)檢出H、R、S、E耐藥基因突變，分布于所測(cè)13個(gè)位點(diǎn)。檢測(cè)顯示，R耐藥140例，耐藥率為23.49%(140/596)；H耐藥160例，耐藥率為26.85%(160/596)，其中6例同時(shí)出現(xiàn)315M和-15M突變；S耐藥88例，耐藥率為14.77%(88/596)，其中1例同時(shí)出現(xiàn)43M和88M突變；E耐藥76例，耐藥率為12.75%(76/596)，其中2例同時(shí)出現(xiàn)306M1和306M2突變。各突變基因位點(diǎn)分布情況見(jiàn)表1。

表1 218例經(jīng)PCR-反向點(diǎn)雜交檢測(cè)發(fā)生耐藥基因突變患者突變位點(diǎn)分布情況

注 D516V表示rpoB基因第516密碼子的D突變?yōu)閂，即天冬氨酸突變?yōu)槔i氨酸。其他氨基酸含義：G-甘氨酸、H-組氨酸、Y-酪氨酸、S-絲氨酸、L-亮氨酸、W-色氨酸、T-蘇氨酸、N-天冬氨酸。315M及-15M 分別表示katG基因第315密碼子和inhA基因第-15密碼子的突變。43M和88M分別代表rpsL基因第43和88密碼子發(fā)生突變。306M1、306M2和306M3代表embB基因第306密碼子發(fā)生不同類型的突變

2. PCR-反向點(diǎn)雜交法與固體藥敏耐藥情況比較：433例患者標(biāo)本同時(shí)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽(yáng)性且同時(shí)PCR-反向點(diǎn)雜交檢測(cè)陽(yáng)性157例，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示耐藥者74例，其中R耐藥59例，耐藥率為37.58%(59/157)；H耐藥45例，耐藥率為28.66%(45/157)；S耐藥37例，耐藥率為23.57%(37/157)；E耐藥19例，耐藥率為12.10%(19/157)。以培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)檢驗(yàn)兩種不同方法對(duì)H、R、S、E的耐藥檢測(cè)情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)Kappa一致性檢驗(yàn)，兩種方法具有較好的一致性。結(jié)果見(jiàn)表2。

討 論

目前，臨床上用于結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)的主要方法是培養(yǎng)法及藥敏試驗(yàn)，被譽(yù)為 “金標(biāo)準(zhǔn)”。但此方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，一般需要4～8周，診斷周期長(zhǎng)，且培養(yǎng)困難，敏感度低，不能及時(shí)指導(dǎo)用藥。隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，結(jié)核分枝桿菌的耐藥突變基因檢測(cè)得到了很快發(fā)展。PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)是將PCR技術(shù)的高敏感度，反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)的高特異性和膜芯片技術(shù)的高通量3種成熟技術(shù)的優(yōu)勢(shì)有效結(jié)合的快速基因診斷手段，可同時(shí)檢測(cè)4種一線藥物的5個(gè)常見(jiàn)耐藥相關(guān)基因上13個(gè)位點(diǎn)的突變。并且，其與培養(yǎng)法及藥敏試驗(yàn)相比，簡(jiǎn)便快速，8 h即可得出結(jié)果。

研究表明，大部分結(jié)核分枝桿菌耐藥性產(chǎn)生的主要原因是藥物作用靶點(diǎn)的基因發(fā)生突變。目前已知的結(jié)核分枝桿菌針對(duì)一線藥物的耐藥相關(guān)基因突變包括：針對(duì)R耐藥的rpoB耐藥核心區(qū)各堿基；針對(duì)H的katG、inhA、ahpC和oxyR基因；針對(duì)E的embA、embB和embC基因；針對(duì)S的rrs、rpsl和strA基因等[2-4]。

本研究應(yīng)用PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)1071例肺結(jié)核患者痰標(biāo)本，596例結(jié)核分枝桿菌基因檢測(cè)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為55.65%；其中，218例發(fā)生耐藥基因突變，分布于所測(cè)13個(gè)位點(diǎn)。H、R、S、E等4種藥物最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)分別位于KatG的315M、rpobB的S531L、rpsl的43M、embB的306M2和306M1，與文獻(xiàn)[5-7]報(bào)道的基本相符。

在實(shí)際應(yīng)用中，基因芯片技術(shù)的結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果具有較高的可靠性，相關(guān)文獻(xiàn)表明其敏感度達(dá)85.5%～100%，特異度達(dá)100%[8-10]，但所示文獻(xiàn)均以PCR-直接測(cè)序?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)。本研究采用PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)H、R、S、E等4種藥物，并以培養(yǎng)法及藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；

表2 PCR-反向點(diǎn)雜交法與藥敏試驗(yàn)對(duì)157例結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)陽(yáng)性患者耐藥檢測(cè)的比較

kappa一致性分析顯示具有中高度一致性，其符合率均在87%以上。由此說(shuō)明，PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)具有可靠性。另外，PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)耐藥基因的特異度均較高(均>90%)，說(shuō)明其造成耐藥菌誤診的可能性小；但敏感度偏低，尤其是S(67.57%)與E(63.16%)，說(shuō)明其造成耐藥菌漏診的概率較高。究其原因，可能為每種藥物均有多個(gè)耐藥基因及位點(diǎn)，本研究?jī)H針對(duì)常見(jiàn)耐藥基因及位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)。

綜上所述，PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)具有快速、可靠的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)早期臨床用藥具有指導(dǎo)作用；但限于檢測(cè)基因的不足，造成診斷敏感度不夠高。因此，有必要進(jìn)一步研究盡可能包含更多突變基因的試驗(yàn)方法。

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(本文編輯：李敬文)

Rapid detection ofMycobacteriumtuberculosisresistant genes using PCR reverse dot blotting hybridization

PENGYi-ping,ZONGPei-lan,XINCha-xiang,XIONGGuo-liang,HUQun-fang,YUANXiao-lan,SHIAn-liang,YAOLin,WANGXiao-lu,WANZan-yan,WUJuan.

TheThirdDepartmentofInternal,JiangxiChestHospital,Nanchang330006,China

PENGYi-ping,Email:pyp74@126.com

Objective To explore the value of PCR reverse dot blotting hybridization in detecting drug-resis-tant gene mutation ofMycobacteriumtuberculosis. Methods A total of 1071 inpatients were enrolled from Jiangxi Chest Hospital in interval between August 2014 and December 2015. All patients were with positive pathology or positive pathogeny, or identified by the criteria of pulmonary tuberculosis with negative smear or culture. PCR reverse dot blot hybridization which was used to detectMycobacteriumtuberculosisdrug-resistant genes, which were included (isoniazid (H), rifampin (R), streptomycin (S) and ethambutol (E) in 1071 sputa samples). The results were compared with result of drug susceptibility test, which usually considered as golden standard, and the efficiency was evaluated. Results Of the 1071 cases were detected by using PCR reverse dot blot hybridization, 596 (55.65%) were TB positive, and H, R, S or E mutant genes distributing in 13 loci were found in 218 cases (36.58%). The most common mutant-gene of H, R, S and E wereKatG-315M (82.53%, 137/166),rpoB-S531L (69.50%, 98/141),rpsl-43M (78.65%, 70/89),embB-306M2 (55.13%, 43/78) andembB-306M1 (39.74%, 31/78), respectively. Additionally, 433 clinical samples were tested with TB culture, and 157 cases had obtained positive results in both of TB culture and dot blot hybridization. By using culture and drug sensitivity results as gold standard, PCR reverse dot blot hybridization had excellent consistency in detecting H, R, S and E compared by adoptingKappatest (Kappaindex were 0.77, 0.73, 0.66 and 0.49, respectively). The sensitities were 88.89% (40/45), 79.66% (47/59), 67.57% (25/37) and 63.16% (12/19), and the specificities were 91.07% (102/112), 91.84% (90/98), 95.00% (114/120) and 91.30% (126/138), respectively. Conclusion PCR reverse dot blot hybridization was reliable to detect the drug-resistant gene mutation ofMycobacteriumtuberculosis, and it was helpful in drug usage guidance.

Polymerase chain reaction;Mycobacteriumtuberculosis; Drug resistance, bacterial; Genes

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.08.004

江西省科技計(jì)劃(20151BBG70124)

330006 南昌，江西省胸科醫(yī)院內(nèi)三科(彭亦平、胡群芳、史安良、姚琳、王小路、萬(wàn)贊燕、吳娟)，內(nèi)一科(宗佩蘭)，檢驗(yàn)科(辛茶香、熊國(guó)亮)，科教科(袁小蘭)

彭亦平，Email: pyp74@126.com

2016-04-29)