化痰法為指導的白芥子相關藥組對肝纖維化大鼠VEGF、bFGF表達的影響*

鄭保平，韓立民，林唐唐，韓　露，唐　楊，劉　真，孫小勇，吳　斌，劉海華，劉金明

(1．贛南醫學院a．第一附屬醫院，江西　贛州　341000; 2．江西中醫藥大學人文學院，江西　南昌　330004)

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化痰法為指導的白芥子相關藥組對肝纖維化大鼠VEGF、bFGF表達的影響*

鄭保平1a，韓立民1，林唐唐1a，韓露2，唐楊1a，劉真1a，孫小勇1a，吳斌1a，劉海華1a，劉金明1a

(1．贛南醫學院a．第一附屬醫院，江西贛州341000; 2．江西中醫藥大學人文學院，江西南昌330004)

摘要:目的:對白芥子及其藥組對實驗性肝纖維化大鼠VEGF、bFGF、CoⅣ、LN的影響進行研究。方法:60只雄性SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組、白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組。除空白對照組外，其余各組均采用大鼠背部皮下注射50%CCl40．1 mL·100 g(－1)，2次·周(－1)，連續造模12周。陽性對照組、白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組于造模的第7周開始給藥，陽性對照組給予秋水仙堿0．4 mg· kg(－1)，白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組的劑量分別為1．0 g·kg(－1)，共7周。采用放射免疫分析法檢測肝組織勻漿CoⅣ、LN，免疫組織化學法檢測各組大鼠肝組織VEGF、bFGF蛋白的表達。結果:模型組與正常組比較: CoⅣ、LN顯著增高(P＜0．01)，VEGF、bFGF蛋白的表達顯著增高(P＜0．05) ;白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組與模型組比較: CoⅣ、LN顯著減低(P＜0．05)，VEGF、bFGF蛋白的表達顯著減低(P＜0．05)。結論:以化痰理論為指導的白芥子及其藥物組合對肝纖維化大鼠有一定的防治作用，其機制可能與影響VEGF、bFGF蛋白的表達有關。

關鍵詞:肝纖維化;白芥子; VEGF; bFGF

近年來，抗肝纖維化治療的研究雖然取得了一定進展，但由于對這種多因素、多環節、多階段的復雜發病機制遠未了解清楚，致使肝纖維化的治療尚未取得顯著性突破。中醫學認為肝纖維化病程遷延，一者耗氣傷陰，致使津液運無力，停積不化，為瘀、為痰;二者犯肝累脾久則及腎，統藏失節，化瘀、化痰。痰瘀互結，痰因瘀阻其凝更固，瘀因痰附其阻愈牢;遂成“痰夾瘀血，遂生窠囊”之頑癥。因此從“痰”著眼，對化痰中藥進行抗肝纖維化的研究很有必要。鑒于白芥子性味“辛溫”，入肝、脾、肺、胃、心與胞絡之經(《本草新編》)，“味辛能散，性溫能行”，能“通經絡”(《得配本草》)，治脅下及皮里膜外之痰(《本草求真》)，有搜剔宣通之功，又不耗損肺、胃、肝、心之氣，入于氣分而實宜，即用于血分而亦當者也”(《本草新編》)的特點［1］，我們在文獻的基礎上就白芥子相關藥組對肝纖維化大鼠VEGF、bFGF的影響進行了研究，現報道如下。

1　材料與方法

1．1材料雄性SD大鼠60只，體重150～210 g，由贛南醫學院實驗動物中心提供。白芥子及丹參、黃芪(由贛南醫學院第一附屬醫院中藥房提供(比例為1∶1) ;秋水仙堿(colchicine，Col)為昆明股份制藥有限公司產品;四氯化碳(CCl4)為北京北化精細化學品有限責任公司產品;層黏連蛋白(laminin，LN)、IV型膠原(collagen type IV，IV-C)放射免疫分析測定盒均為上海海軍醫學研究所生物技術中心產品;鼠抗bFGF單克隆抗體，兔抗VEGF多克隆抗體，兔SPkit及DAB等均購自武漢博士的有限公司。

1．2方法

1．2．1模型制備及給藥60只大鼠適應性飼養1周后，按體重隨機分為空白對照組、模型組、秋水仙堿對照組、白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組，共6組，每組10只大鼠。除空白對照組注射等量的生理鹽水外，其它組均背部皮下注射50% CCl40．1 mL·100 g－1，2次·周－1，連續造模12周。造模第7周開始，空白對照組和模型組灌胃蒸餾水，秋水仙堿組以0．4 mg·kg－1，白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組均為1．0 g·kg－1(體重)，按2 mL·100 g－1，每日分2次，連續灌胃7周［2］。

1．2．2標本采集及處理末次造模48 h時后，采用頸椎脫臼處死大鼠，取肝左葉相同部位組織于10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定，常規取材、脫水、包埋，按照免疫試劑盒說明操作以檢測VEGF、bFGF，以PBS代替一抗作陰性對照。其余肝組織稱重后用生理鹽水制備5%的勻漿，2 000 r·min－1離心10 min取上清液，采用放射免疫法檢測肝組織勻漿CoⅣ、LN。

1．2．3結果判定VEGF、bFGF以胞質出現棕黃色顆粒為陽性細胞。①先按染色強度打分:無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;②再按陽性細胞百分比打分:陰性為0分，小于10% 為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，75%以上為4分。將①②兩者的積分相乘，總分0 ～1分(－)，2～3分(+ )，4～5分(+ + )，6～7分(+ + + )。

1．2．4統計分析應用SPSS 13．0統計學軟件進行統計學分析。計量指標的數據資料以±s表示，各組間測定指標的總體比較采用單因素方差分析;計數資料進行Ridit分析［3］，P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

2．1白芥子及其藥組對肝纖維化大鼠模型肝組織勻漿CoⅣ、LN含量的影響模型組與正常組比較CoⅣ、LN顯著增高，有統計學意義(P＜0．01) ;陽性對照組與模型組比較CoⅣ、LN顯著減低，有統計學意義(P＜0．05) ;白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組與模型組比較CoⅣ、LN顯著減低，有統計學意義(P＜0．05)。結果見表1。

表1化痰法對肝纖維化模型大鼠肝組織勻漿CoⅣ、LN的影響/±s，ng·mL－1

表1化痰法對肝纖維化模型大鼠肝組織勻漿CoⅣ、LN的影響/±s，ng·mL－1

注:與正常組比較，△P＜0．01;與模型組比較，* P＜0．05。

組別　　動物數LN　CoIV正常對照組10　 58．96±14．02　 25．07±10．6模型對照組　10　 115．01±20．47△57．42±13．21陽性對照組　10　 100．28±22．35*46．72±11．92*白芥子組　10　 97．01±17．97*46．66±8．99*白芥子+丹參組　9　 93．34±16．73*43．23±7．92*白芥子+黃芪組　10　 95．76±19．33*44．72±9．63*△

2．2白芥子及其藥組對肝纖維化大鼠模型肝組織VEGF、bFGF的影響模型組與正常組比較VEGF、bFGF顯著增高，有統計學意義(P＜0．01) ;陽性對照組與模型組比較VEGF、bFGF無統計學意義;白芥子組、白芥子+丹參組、白芥子+黃芪組與模型組比較VEGF、bFGF顯著降低，有統計學意義(P＜0．05)。結果見表2。

表2化痰法對肝纖維化模型大鼠肝組織VEGF、bFGF的影響/±s

注:與正常組比較，△P＜0．05;與模型組比較，※P＜0．05。

組別　　動物數　VEGF bFGF－　+　 + +　 + + +正常對照組－　+　 + +　 + + + 10　 9　 1　 0　 0　 10　 0　 0　 0模型對照組△　10　 0　 2　 5　 2　 0　 3　 4　 3陽性對照組　10　 0　 3　 6　 1　 0　 2　 6　 2白芥子組※　10　 1　 5　 4　 0　 1　 4　 4　 1白芥子+丹參組※　9　 1　 5　 2　 1　 1　 3　 5　 0白芥子+黃芪組※10　 1　 6　 3　 0　 1　 5　 4　 0

3　討論

肝纖維化是慢性肝病演變為肝硬化的必經階段，肝細胞損傷后以膠原為主的細胞外基質(ECM)合成增多，降解相對不足，沉積在肝內引起纖維化。HSC的激活是肝纖維化發生的中心環節，而細胞因子在HSC的激活、調節ECM生成方面發揮著重要作用，是近年來抗肝纖維化的研究熱點。bFGF主要由肝竇內皮細胞、血管內皮和肝細胞等分泌，是成纖維細胞生長因子家族中的一員，是一個重要的有絲分裂原和血管生成因子。在肝病的早期階段，由于肝組織發生微循環障礙而合成bFGF增加，刺激內皮細胞增生［4］。在肝病的中后期，bFGF在肝血管間隔及肝竇壁表達逐漸增強的同時，尚伴隨α-SMA、FN、LN、ColV等強表達，表明bFGF另一個重要功能是促進細胞外基質(ECM)的產生［5］。因此bFGF一方面直接參與了肝纖維化的形成，同時又為其他細胞因子在肝組織局部發揮作用創造了條件［5］。本研究顯示模型組大鼠bFGF顯著增高，亦說明其參與了肝纖維的形成和發展，而白芥子相關藥組干預后大鼠肝組織中的bFGF及CoⅣ、LN均顯著下降，與模型組相比有顯著差異(P﹤0．05)，說明白芥子及其相關藥組可能是通過抑制bFGF的合成和分泌，一方面抑制內皮細胞增生、遷移及分化，影響新血管的生成，干擾肝竇毛細血管化的形成。另一方面，通過影響CoⅣ、LN的合成而起到抗肝纖維化作用的。

在肝纖維化發展過程中，新生血管化顯著增高［6－7］。而具有血管生成抑制劑活性的藥物，可抑制實驗性肝纖維化的進展［8］，表明血管發生在肝纖維化的發展過程中起著重要作用。血管生成促進因子與血管生成抑制因子之間的平衡調節著血管形成。正常肝組織VEGF及其受體表達量極低，在肝纖維化發展過程中VEGF及其受體表達均顯著增高。研究發現VEGF參與了肝竇毛細血管的形成［9］。本研究顯示白芥子及其藥組對肝纖維化大鼠模型進行干預后，肝組織中VEGF的表達明顯下降，與模型組有顯著差異(P﹤0．05)，說明白芥子相關藥組可能通過抑制VEGF的合成和分泌，進而阻斷肝竇毛細血管化的形成而起到抗肝纖維化作用的。

參考文獻:

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Effects of Semen Sinapis Albae Related Medicine Groups on the Expression of VEGF and bFGF in Rats with Hepatic Fibrosis under the Guidance of Resolving Phlegm

ZHENG Bao-ping1，HAN Li-min2，LIN Tang-tang1，HAN Lu3，TANG Yang1，LIU Zhen1，SUN Xiao-yong1，WU Bin1，LIU Hai-hua1，LIU Jin-ming1
(1．The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University; 2．Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000; 3．College of humanities，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang，Jiangxi 330004)

Abstract:Objective: To study the effects of semen sinapis albae related medicine groups on VEGF，bFGF，CoⅣand LN in rats with hepatic fibrosis．Methods: 60 male SD rats were randomly divided into blank control group，model group，positive control group，semen sinapis albae group，semen sinapis albae and salvia miltiorrhiza group，semen sinapis albae and astragalus membranaceus group．Rats of all groups except the control group were modeled by hypodermic injection of 0．1 mL·100 g(－1)50%CCl4twice per week for 12 weeks continuously．The positive control group，semen sinapis albae group，semen sinapis albae and salvia miltiorrhiza group，semen sinapis albae and astragalus membranaceus group were given medicine at the beginning of the seventh week; the positive control group was given colchicine 0．4 mg·kg(－1); semen sinapis albaegroup，semen sinapis albae and salvia miltiorrhiza group，semen sinapis albae and astragalus membranaceus group were given corresponding medicines 1．0 g·kg(－1)，7 weeks in all．Radioimmunoassay method was adopted to detect the level of CoⅣand LN in the liver homogenate．Immunohistochemical method was employed to detect the expression of VEGF and bFGF in liver tissues of rats in each group．Results: Compared with the normal group，the level of Cobook=18,ebook=25Ⅳand LN in the model group were significantly increased (P＜0．01)，and the expression of VEGF and bFGF were significantly increased(P＜0．05)．Compared with the model group，the level of CoⅣand LN in the semen sinapis albae group，semen sinapis albae and salvia miltiorrhiza group，semen sinapis albae and astragalus membranaceus group were significantly reduced(P＜0．05)，and the expression of VEGF and bFGF were significantly reduced(P＜0．05)．Conclusion: The semen sinapis albae related medicine groups under the guidance of resolving phlegm have a certain preventive and therapeutic effect on hepatic fibrosis rats．The mechanism may be related to the expression of VEGF and bFGF．

Key words:hepatic fibrosis; semen sinapis albae; VEGF; bFGF

(收稿日期:2015－12－03) (責任編輯:敖慧斌)

*基金項目:國家自然科學基金項目(NO: 81460707) ;江西省衛生廳中醫藥科研基金(NO: 2012A050) ;贛南醫學院重點項目(NO: ZD201203)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．004

中圖分類號:R285．5

文獻標志碼:A

文章編號:1001－5779(2016) 01－0017－04