染料木素磺酸鈉對去卵巢大鼠骨代謝相關(guān)指標(biāo)的影響*

朱文清，陳金財，姬廣林，黃志華

(贛南醫(yī)學(xué)院a．第一附屬醫(yī)院骨科; b．機(jī)能實驗室，江西　贛州　341000)

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染料木素磺酸鈉對去卵巢大鼠骨代謝相關(guān)指標(biāo)的影響*

朱文清a，陳金財a，姬廣林a，黃志華b

(贛南醫(yī)學(xué)院a．第一附屬醫(yī)院骨科; b．機(jī)能實驗室，江西贛州341000)

摘要:目的:研究染料木素磺酸鈉對去卵巢模型大鼠骨代謝的影響。方法:用去卵巢方法建立大鼠骨代謝紊亂動物模型，選擇48只雌鼠，隨機(jī)分為6組:正常對照組、骨質(zhì)疏松模型組、陽性藥物組、低劑量GSS組(0．1 mg· kg(－1))、中劑量GSS組(0．3 mg·kg(－1))、高劑量GSS組(1．0 mg·kg(－1))。建模1周后，分別給予生理鹽水、雌激素和不同劑量的染料木素磺酸鈉，給藥6周后，檢測大鼠骨長度和骨重量指數(shù)，同時檢測血清電解質(zhì)、堿性磷酸酶(AKP)、骨鈣素(BGP)和肝組織抗酒石酸酸性磷酸酶(TrACP-5b)等生化指標(biāo)。結(jié)果:與模型組相比(1) GSS可以增高腰椎、股骨及脛腓骨重量指數(shù)，同時增大股骨和脛骨長度指數(shù)(P＜0．001) ; (2) GSS可降低血清中骨鈣素的含量，提高降鈣素的含量(P＜0．001) ; (3) GSS能升高血清AKP，降低TrACP-5b的含量(P＜0．01)。結(jié)論: GSS可通過調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收途徑，從而改善去卵巢大鼠骨代謝的紊亂，對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥可能起治療作用。

關(guān)鍵詞:染料木素磺酸鈉;去卵巢大鼠;骨代謝

染料木素磺酸鈉(Genistein Sulfonate Sodium，GSS)是染料木素磺化后合成的衍生物，相對于其母體不僅保留弱雌激素樣作用等藥理作用，同時由于GSS水溶性好，更易于人體吸收。前期研究發(fā)現(xiàn)GSS可以提高去卵巢大鼠的LEE’S指數(shù)并改善脂代謝情況［1］，本研究擬通過建立去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松模型，觀察骨代謝的相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)一步明確GSS對去卵巢大鼠骨代謝影響。

1　材料與方法

1．1實驗動物3月齡SPF級SD大鼠，雌性，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供(動物合格證號: HNASLK20120825)，每日均給予普通全價飼料(購自贛南醫(yī)學(xué)動物實驗室)喂養(yǎng)，自由飲水。

1．2試劑、藥物、材料GSS購自上海天習(xí)化工有限公司，分子量為372，用生理鹽水溶解配制成所需濃度;戊酸雌二醇由拜耳公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號030A;血清骨鈣素(bone gla protein，BGP)和降鈣素(calcitonin，CT)試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司) ;血清堿性磷酸酶(alkaline aphosphatase，AKP)和抗酒石酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TrACP-5b)測試盒(南京建成生物工程研究所)。

1．3主要實驗儀器MIKRO22R臺式冷凍離心機(jī)(德國Hittch公司) ; Model 680全自動酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司) ; SN-695型智能放免γ測量儀(上海核輻光電儀器有限公司)。

1．4方法

1．4．1實驗分組及動物模型制備選擇體質(zhì)量為160～200 g的健康SD雌鼠48只，隨機(jī)分為6組，每組8只: (A)正常對照組，(B)骨質(zhì)疏松模型組，(C)陽性藥物組，(D) 0．1 mg·kg－1GSS組，(E) 0．3 mg ·kg－1GSS組，(F) 1．0 mg·kg－1GSS組。大鼠用10%的水合氯醛麻醉大鼠后，于平臥位消毒，打開腹腔，行雙側(cè)卵巢切除;正常對照組僅探查卵巢，不切除，余操作同模型組。術(shù)后1周各組行陰道脫落細(xì)胞檢查，以明確卵巢切除成功。陽性藥物組按80 mg·kg－1戊酸雌二醇混懸液灌胃，GSS治療組分別按0．1 mg·kg－1、0．3 mg·kg－1和1．0 mg·kg－1劑量灌胃，給藥體積為0．5 mL·100 g－1體重，對照組及骨質(zhì)疏松模型組大鼠給予等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)6周。

1．4．2血清血生化檢測電解質(zhì)和AKP、TrACP-5b的活性給藥6周后，麻醉大鼠，腹腔動脈取血，2 000 rpm·min－1，4℃，離心15 min，分離血清，于－80℃冰箱保存。電解質(zhì)儀檢測血清鈣、鎂和磷的水平;酶分析方法檢測血清AKP和TrACP-5b活性。

1．4．3放射免疫學(xué)方法檢測血清BGP和CT指標(biāo)

取血清，解凍后，3 000 rpm·min－1，離心10 min，取上清100 μL于已編寫號碼的放免專用試管中，加入相應(yīng)的抗血清100 μL，混勻，再分別加入125I標(biāo)記的BGP、CT，混勻，另設(shè)總放射值管、非特異反應(yīng)管(不加入抗血清)及標(biāo)準(zhǔn)管(S0～S5)，4℃孵育24 h。除總放射管值外，每管加入免疫分離劑500 μL，充分混勻，室溫放置20 min后，4℃，3 000 rpm· min－1，離心10 min，棄上清，在SN-695型智能放免γ測量儀上測定cpm值，半對數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計算每管血清BGP、CT的含量。

1．4．4骨重量及長度指數(shù)檢測分別稱量腰椎、股骨和脛腓骨重量，測量股骨和脛腓骨長度，計算腰椎、股骨和脛腓骨重量指數(shù)(骨質(zhì)重量/大鼠重量)，股骨和脛腓骨長度指數(shù)(骨質(zhì)重量/骨質(zhì)長度)。

1．5統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用prism 5．0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各測量指標(biāo)的數(shù)據(jù)資料以±s表示，組間各測定指標(biāo)的總體比較采用單因素方差分析，組內(nèi)各指標(biāo)的多重比較采用SNK檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2．1 GSS對血清Ca2 +、Mg2 +、P含量的影響結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠血清Ca2 +和Mg2 +含量降低、P含量升高(P＜0．05) ;與模型組相比，陽性藥物組血鈣水平升高，血磷下降(P＜0．05)，GSS各組血Ca2 +含量升高(P＜0．05)，血P含量與模型組無明顯差異(表1)。

表1 GSS去卵巢大鼠血清電解質(zhì)含量的影響Table 1 GSS serum electrolytes to influence the content of ovariectomized rats

2．2 GSS對血清AKP活性和肝組織STrACP活性的影響AKP結(jié)果表明，與對照組相比，模型組大鼠血清AKP活性降低(P＜0．05)，肝組織STrACP-5b活性升高(P＜0．01) ;與模型組相比，陽性藥物組肝組織STrACP-5b活性降低(P＜0．01)，GSS治療組AKP活性升高(P＜0．05)，肝組織STrACP-5b活性降低(P＜0．01) (表2)。

表2 GSS對血清AKP及肝臟STrACP-5b活性的影響Table 2 GSS on serum AKP and liver STrACP-5b activity

2．3 GSS對血清BGP和CT含量的影響結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠血清BGP水平升高(P＜0．001)、CT含量降低(P＜0．05) ;與模型對照組相比，陽性藥物組血清BGP水平降低(P＜ 0．001)、CT含量升高(P＜0．05)，GSS各治療組BGP含量降低(P＜0．05，P＜0．01，P＜0．001)、CT含量升高(P＜0．05) (表3)。

表3 GSS對血清骨鈣素(BGP)、降鈣素(CT)的影響Table 3 GSS influence on serum osteocalcin (BGP) and calcitonin (CT)

2．4 GSS對骨密度、骨長度和骨重量指數(shù)的影響

結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠的股骨和脛骨長度指數(shù)(P＜0．05，P＜0．001)和腰椎、股骨及脛腓骨重量指數(shù)均減小; GSS治療6周后，股骨、脛骨長度指數(shù)和腰椎、股骨、脛腓骨重量指數(shù)均提高(P＜0．05，P＜0．01) (表4)。

表4 GSS對去卵巢大鼠骨長度和骨重量指數(shù)的影響

3　討論

目前包括兔子、狗、猴等許多物種用于制作動物骨質(zhì)疏松模型，其中實驗鼠因操作簡單，成本低，實驗要求差異性最少所以成為最常用的模型動物。實驗鼠模型制作方法很多，有卵巢、睪丸、垂體切除，也有使用激素類藥物，且最終都能達(dá)到骨丟失的目的，但是最終仍然是通過生化檢查、骨形態(tài)計量學(xué)等方法監(jiān)測和評價該動物模型在預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥的效果［2］。

正常情況下，骨形成和骨吸收通過各種調(diào)節(jié)信號緊密相連。當(dāng)骨吸收越活躍并引起骨密度降低和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞時，就會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，隨之而來就是骨脆性增加和骨折風(fēng)險增加。骨質(zhì)疏松癥并發(fā)癥脆性骨折可使病人致殘，嚴(yán)重危及病人生活質(zhì)量［3］。盡管骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)是嚴(yán)重威脅老年人健康的疾病，但是如何診斷和評估骨質(zhì)疏松癥危害性卻一直沒有定論。國內(nèi)外比較常用是通過雙能X線進(jìn)行骨密度檢測，因為其直接有效的檢測和診斷方法，所以在臨床上已廣泛的使用［4］，但是最近研究認(rèn)為它僅僅能檢測受測部位的骨代謝，不能做全身骨質(zhì)情況評估，更不能很好的預(yù)測患者骨折的風(fēng)險，因此評估骨質(zhì)疏松的風(fēng)險往往需要綜合個體情況及生化指標(biāo)來完成［5］。骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)(bone turnover markers，BTMs)雖然不是診斷骨質(zhì)疏松的標(biāo)準(zhǔn)，臨床效用有限，但是抗骨質(zhì)疏松治療后，可以通過骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)全面評價人體骨的代謝情況，從而間接判斷抗骨質(zhì)疏松效果并預(yù)測骨折的風(fēng)險，因此得到不少學(xué)者高度重視［6］。

成骨細(xì)胞(Osteoblast，OB)和破骨細(xì)胞(Osteoclast，OC)是骨代謝最重要的核心細(xì)胞，骨代謝的關(guān)鍵就是這兩種細(xì)胞代謝變化的結(jié)果［7－8］。目前反應(yīng)成骨細(xì)胞標(biāo)志物較多，其中包括AKP，BGP，I型前膠原羧基末端肽(PICP)等。其中AKP和BGP因擁有較好的生物穩(wěn)定性、較低的個體差異性而且檢測方法簡單已經(jīng)成為評估成骨細(xì)胞活性的重要手段［9］，PICP同樣作為成骨代謝產(chǎn)物也是反應(yīng)成骨細(xì)胞活性的重要指標(biāo)，但是其結(jié)果易受干擾，如半衰期只有6～8分鐘［10］，且體內(nèi)受不同時間變化而變化，研究發(fā)現(xiàn)PICP凌晨比中午人體含量高20%，Vasikaran S等人研究認(rèn)為PICP來源可能不僅僅于骨代謝，因此沒有很好的特異性，因此一定程度上限制其實踐運用［11］。TrACP是目前臨床上判斷成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性的重要的生化標(biāo)志物，也是骨質(zhì)疏松癥重要監(jiān)測指標(biāo)之一。體外實驗證明，在骨吸收過程中，破骨細(xì)胞活躍，同時大量分泌TrACP，因此TrACP水平可反映破骨細(xì)胞活性和骨吸收狀態(tài)。絕經(jīng)期后的女性因為內(nèi)源性雌激素減少，骨重建失衡，骨吸收大于骨形成，會出現(xiàn)TrACP顯著增加。在正常人血清中，TrACP以兩種基化形式存在: TrACP-5a和TrACP-5b。其中TrACP-5b則主要由破骨細(xì)胞分泌。故測定血清中的TrACP-5b活性，可以反映體內(nèi)OC活性和骨吸收狀態(tài)。目前研究認(rèn)為TrACP-5b的活性直接反應(yīng)了OC在骨組織中的數(shù)量，是反映OC活性的特異性指標(biāo)，目前已經(jīng)成為第二代骨吸收生化標(biāo)志［12－13］。試驗中GSS組尤其是中劑量組可以提高AKP活性，降低肝組織STrACP-5b活性，側(cè)面反映其可以提高成骨細(xì)胞活性，抑制破骨細(xì)胞活性，達(dá)到改善骨代謝作用。

通過實驗我們發(fā)現(xiàn)，GSS能提高成骨細(xì)胞數(shù)量和功能，同時產(chǎn)生類雌激素對破骨細(xì)胞的抑制作用，而且綜合各項指標(biāo)，中劑量組更為明顯，符合不少學(xué)者認(rèn)為類雌激素藥物效果并非量大為好的觀點。綜上，GSS通過對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用，在整體上對絕經(jīng)后的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥進(jìn)行改善，降低骨折風(fēng)險，為進(jìn)一步臨床運用提供理論基礎(chǔ)。

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Effects of Genistein Sulfonate Sodium on Related Indexes of Bone Metabolism in Ovariectomized Rats

ZHU Wen-qing1，CHEN Jin-cai1，JI Guang-lin1，HUANG Zhi-hua2
(1．Dept．of Orthopedics，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University; 2．Research Center of Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000)

Abstract:Objective: To observe the effect of Genistein Sulfonate Sodium(GSS) on bone metabolism in ovariectomized rat．Methods: 48 female SD rats were randomly divided into 6 groups: control group，ovariectomized model group，positive drug group，and difference dose of GSS groups (0．1，0．3，1．0 mg·kg(－1))．After one week following ovariectomy，the rats were administrated saline，estradiol valerate or GSS by ig once a day．Six weeks later，the rats were sacrificed，their serum was taken to detect electrolytes，bone gla protein (BGP)，calcitonin (CT) and alkaline aphosphatase (AKP)，and their liver tissues were make to observe tartrate-resistant acid phosphatase (TrACP-5b)．Then the rats were detected bone length and mass index．Results: Compared with the model group，(1) GSS can increase lumbar spine，femur，tibia and fibula weight index，and increase the length index of the femur and tibia(P＜0．001) ; (2) GSS can reduce serum BGP，and improve the content of calcitonin(P＜0．001) ; (3) GSS can elevate serum AKP level and reduce liver TrACP-5b content(P＜0．01)．Conclusion: GSS can improve bone metabolism in ovariectomized rats by regulating bone formation and resorption way，and provide a potential therapeutic approach for postmenopausal osteoporosis．

Key words:Genistein Sulfonate Sodium; ovariectomized rats; bone metabolism

(收稿日期:2015－08－24) (責(zé)任編輯:敖慧斌)

通訊作者:黃志華，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事心腦血管疾病研究。E-mail: gnyxyhzh@163．com

*基金項目:國家自然科學(xué)基金(NO．31360250) ;江西省衛(wèi)計委(NO．20155465) ;贛州市科技局(NO．GZ2014ZSF025)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．003

中圖分類號:R285．5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－5779(2016) 01－0013－04