染料木素磺酸鈉對腦缺血再灌注損傷大鼠ATP酶活性的影響*

黎　曉，謝佳麗，賴麗娟，李玉磊，邱　平，李良東，黃志華，黃　誠

(贛南醫學院基礎醫學院，江西　贛州　341000)

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染料木素磺酸鈉對腦缺血再灌注損傷大鼠ATP酶活性的影響*

黎曉，謝佳麗，賴麗娟，李玉磊，邱平，李良東，黃志華，黃誠

(贛南醫學院基礎醫學院，江西贛州341000)

摘要:目的:觀察染料木素磺酸鈉(GSS)對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠Na+-K+-ATPase和Ca(2 +)-Mg(2 +)-ATPase活性的影響，研究其對腦缺血時能量代謝的改善作用。方法:采用大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)動物模型，Longa評分方法行神經功能學評分，TTC染色方法測定腦梗死范圍，酶活性分析檢測技術檢測Na+-K+-ATPase和Ca(2 +)-Mg(2 +)-ATPase活性。結果: MCAO再灌注模型組大鼠均出現不同程度的神經功能損傷和腦梗死，缺血側腦組織Na+-K+-ATPase和Ca(2 +)-Mg(2 +)-ATPase活性降低; GSS治療后，神經功能評分降低，腦梗死體積縮小，腦組織兩種ATPase活性均升高。結論: GSS對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，改善腦細胞能量代謝障礙是其機制之一。

關鍵詞:腦缺血再灌注損傷;染料木素磺酸鈉;能量代謝

腦血管疾病是目前嚴重危害人類健康的主要疾病之一。其以高發病率、高致殘率、高死亡率及高復發率嚴重影響人類的健康。腦缺血再灌注損傷是一個復雜的病理生理過程，腦血流中斷和再灌注使腦細胞產生損傷是一個快速的級聯反應，這個級聯反應包括許多環節，如腦能量障礙、細胞酸中毒、興奮性氨基酸毒性、細胞內鈣失穩態、自由基損傷、炎癥細胞因子損害及凋亡基因激活等［1］。目前治療腦梗死的藥物主要有抗血小板凝集藥物、抗凝劑、溶栓藥、血管擴張劑、神經營養藥物等。然而，療效顯著、不良反應小、從多靶點、多環節發揮作用的治療腦梗死及改善患者預后的藥物仍十分稀少。研究表明，雌激素具有很好的腦保護作用［2］，植物雌激素具有弱雌激素作用的同時能減少雌激素帶來的一系列不良反應，因此在臨床應用方面具有廣闊的前景。染料木素磺酸鈉(genistein sodium sulfonate，GSS)，是由染料木素(一種植物雌激素)進行磺化合成，為強水溶性化合物。前期研究表明，GSS對腦缺血再灌注損傷具有保護作用［3］，然而，其保護機制仍不清楚。本實驗通過應用大腦中動脈栓塞(middle artery occlusion，MCAO)所致的局灶性腦缺血再灌注損傷模型，觀察GSS對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠Na+-K+-ATPase和Ca2 +-Mg2 +-ATPase活性的影響，研究其對腦缺血時能量代謝的改善作用。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1實驗動物雄性SD大鼠，體重250～280 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(動物中心許可證號: SCXK(湘) 2011－0003，動物合格證號: 43004700003244，級別: SPF級)。

1．1．2主要試劑染料木素磺酸鈉(C15H10O8SNa)購自上海習氏化工有限公司，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-tripheyltetrazolium，TTC) (貨號: T8877 －25G )購自Sigma公司;超微量Na+-K+-ATPase 和Ca2 +-Mg2 +-ATPase檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所(貨號: A070－6，批號: 201220423)。

1．2實驗方法

1．2．1大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的制備

參照Longa等［4］的方法制備大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注模型，即局灶性腦缺血再灌注損傷模型。SPF級SD大鼠，雄性，體重250～280 g，大鼠用10%水合氯醛溶液(350 mg·kg－1，ip)麻醉，作頸部正中切口，分離頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，于向心端夾閉頸總動脈、遠心端夾閉頸內動脈，于頸外動脈切口，將一尼龍線(長4 cm，線體直徑0．26 mm，頭端直徑0．36 mm)經頸外動脈切口緩慢向頸內動脈入顱方向推進，以頸總動脈分叉處為標記，推進18～20 mm感到輕微阻力時，即達到較細大腦前動脈，阻斷大腦中動脈的所有血液供應，2 h后，拔出尼龍線至頸外動脈處，并剪去尼龍線殘端，完成腦缺血再灌注損傷模型。假手術組大鼠只暴露和分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，并結扎頸外動脈，不閉塞大腦中動脈。術中嚴格控制室溫在23℃～25℃。

1．2．2實驗分組及給藥方法將大鼠隨機分成5組:假手術組、腦缺血再灌注損傷模型組、GSS低劑量(0．5 mg·kg－1)、GSS中劑量(1 mg·kg－1)及GSS高劑量(2 mg·kg－1)治療組。藥物治療組于缺血后10 min分別從舌下靜脈注射不同劑量的GSS，假手術組和模型組給予同體積的生理鹽水。

1．2．3神經功能評分大鼠再灌注24 h后，進行Longa氏評分［4］，分值越高神經功能缺陷越顯著。神經功能行為評分標準: 0分，未觀察到神經功能缺陷癥狀; 1分，不能完全伸展手術對側前爪(輕度局灶性神經功能缺陷) ; 2分，向手術對側轉圈(中度局灶性神經功能缺陷) ; 3分，向手術對側傾倒(重度神經功能缺陷) ; 4分，不能自發行走，意識昏迷。

1．2．4腦梗死體積測定再灌注24 h后，大鼠麻醉后，斷頭取腦，將大腦置于大鼠腦模具中，用薄刀片沿冠狀面切成厚約2 mm腦片5片，置于0．5% TTC染色溶液中，37℃避光孵育10 min。經染色后非缺血區呈玫瑰紅色，腦梗死區呈灰白色。將腦片置于4%多聚甲醛中固定。固定好的腦片濾紙吸干后按順序擺放，數碼相機照相，采用DT-2000圖象分析軟件測算出各切面的腦梗死面積，再根據公式計算出腦梗死體積，考慮腦水腫的影響，采用校正后的梗死體積公式［5］:校正梗死體積=測量的梗死面積×{ 1－［(同側半球面積－對側半球面積) /同側半球面積］}，各腦片梗死面積之和乘以厚度(2 mm)為總的梗死體積，將梗死體積占全腦體積的百分比進行數據分析。

1．2．5腦組織酶活性檢測再灌注24 h后，大鼠麻醉后。斷頭取腦，并將左側前腦于冰浴中加入生理鹽水(腦組織重量∶生理鹽水體積= 1∶9)制成10%的組織勻漿，4℃，3 500 rpm·min－1，離心10 min，取上清，于－80℃保存。嚴格按試劑盒說明，測定腦組織Na+-K+-ATPase和Ca2 +-Mg2 +-ATPase的活性。

1．2．6統計學方法應用Prism 5．0統計學軟件對數據進行統計學分析。各測量指標的計量資料以±s表示，組間各測定指標的總體比較采用單因素方差分析，組內各指標的多重比較采用SNK檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

2．1神經功能評分圖1所示，MCAO再灌注模型組大鼠均出現不同程度的神經功能損傷，1．0 mg· kg－1(P＜0．01)及2．0 mg·kg－1GSS(P＜0．05)治療后，大鼠腦缺血再灌注損24 h后神經功能評分降低，神經功能提高。

圖1　GSS對MCAO大鼠神經功能評分的影響

2．2腦梗死范圍圖2及圖3所示，腦片TTC染色后正常腦組織染成紅色，損傷區染成白色，1．0 mg· kg－1(P＜0．05)及2．0 mg·kg－1GSS(P＜0．001)治療組可減小大鼠缺血再灌注24 h后腦梗死體積。提示在整體動物水平，GSS對腦缺血再灌注損傷有較好的保護作用。

圖2　GSS對大鼠腦梗死范圍的影響

圖3　GSS對大鼠腦梗死體積的影響

2．3 GSS對MCAO再灌注大鼠缺血側腦組織Na+-K+-ATPase和Ca2 +-Mg2 +-ATPase活性的影響圖4及圖5所示，MCAO模型大鼠缺血側腦組織Na+-K+-ATPase和Ca2 +-Mg2 +-ATPase的活性均降低，與假手術組相比，差異有統計學意義(P＜0．01，P＜0．001) ; GSS治療后，大鼠缺血側腦組織ATPase活性升高，與模型組相比有統計學意義(P＜0．05)。

圖4　GSS對鈉鉀ATPase活性的影響

圖5　GSS對鈣鎂ATPase活性的影響

3　討論

腦缺血缺氧時，腦組織Na+-K+-ATPase活性降低［6］，這是由于缺血缺氧時，神經細胞氧化磷酸化能力減弱，ATP合成減少，消耗增多，Na+-K+泵功能降低。Na+-K+-ATPase活性降低，可進一步導致細胞膜對Na+和K+的轉運障礙，通過以下兩個方面造成腦組織損傷。

一方面，Na+和K+跨膜轉運不足可引起細胞膜靜息電位下降，激活電壓依賴性鈣通道，導致大量Ca2 +內流;腦損傷后的缺血、缺氧反應引起神經元突觸前膜興奮性氨基酸囊泡大量破裂，釋放至突觸間隙，激活神經元突觸后膜的NMDA受體，使受體依賴性Ca2 +通道開放，也可引起Ca2 +大量內流。內質網可調節Ca2 +的攝取和釋放，維持細胞內Ca2 +穩態，其中Ca2 +-Mg2 +-ATPase起重要作用。腦缺血時Ca2 +-Mg2 +-ATPase活性下降［7－8］，不能將Ca2 +泵入內質網。Ca2 +在神經細胞內蓄積，形成“鈣超載”，誘發一系列病理反應，促發和加劇繼發性腦損傷。

另一方面，腦細胞水腫是缺血后最早出現的形態學變化，其產生原因是由于膜去極化引起的過多的Na+和Ca2 +內流。越來越多的證據表明，能量代謝不足和Na+-K+-ATPase功能障礙是缺血引起的細胞損傷的重要因素［9］。

本實驗結果顯示，腦組織缺血再灌注損傷后，Na+-K+-ATPase及Ca2 +-Mg2 +-ATPase活性降低，與文獻報導一致。GSS治療后，兩種ATP酶活性均升高，提示GSS可通過改善缺血腦組織能量代謝，進而減輕腦細胞水腫及“鈣超載”起腦保護作用。

參考文獻:

［1］Majid A．Neuroprotection in Stroke: Past，Present，and Future［J］．ISRN Neurol，2014: 515716．

［2］Han D，Scott EL，Dong Y，et al．Attenuation of mitochondrial and nuclear p38α signaling: a novel mechanism of estrogen neuroprotection in cerebral ischemia［J］．Mol Cell Endocrinol，2015，400: 21－31．

［3］鐘星明，黃志華，龔衍，等．染料木素磺酸鈉對腦缺血再灌注損傷的保護作用及DREAM和PSD95的表達變化［J］．中風與神經疾病雜志，2013，30(8) : 697－699．

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlsons，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats ［J］．Stroke，1989，20(1) : 84－91．

［5］尚進林，孫莉，梁浩，等．過氧化物酶體增殖物激活受體1激動劑對小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用［J］．中華神經科雜志，2009，42(3) : 190－194．

［6］Xu H，Yu X，Qu S，et al．Protective effect of Panax quinquefolium 20(S) -protopanaxadiol saponins，isolated from Pana quinquefolium，on permanent focal cerebral ischemic injury in rats［J］．Exp Ther Med，2014，7(1) : 165－170．

［7］Parsons JT，Churn SB，DeLorenzo RJ．Ischemia-induced inhibition of calcium uptake into rat brain microsomes mediated by Mg2 +/Ca2 +ATPase［J］．J Neurochem，1997，68(3) : 1124－1134．

［8］Liu X，Yue R，Zhang J，et al．Neuroprotective effects of bacopaside I in ischemic brain injury［J］．Restor Neurol Neurosci，2013，31(2) : 109－123．

［9］Song M，Yu SP．Ionic regulation of cell volume changes and cell death after ischemic stroke［J］．Transl Stroke Res，2014，5(1) : 17－27．

(Continued from p8)

［49］L．Yu，F．Yang，L．Jiang，et al．Exosomes with membrane-associated TGF-beta1 from gene-modified dendritic cells inhibit murine EAE independently of MHC restriction［J］．Eur J Immunol，2013，43 (9) : 2461－2472．

［50］X．Zhuang，X．Xiang，W．Grizzle，et al．Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region to the brain［J］．Mol Ther，2011，19 (10) : 1769－1779．

［51］K．Skriner，K．Adolph，P．R．Jungblut，et al．Association of citrullinated proteins with synovial exosomes ［J］．Arthritis Rheum，2006，54 (12) : 3809－3814．

［52］N．R．Bianco，S．H．Kim，M．A．Ruffner，et al．Therapeutic effect of exosomes from indoleamine 2，3-dioxygenase-positive dendritic cells in collagen-induced arthritis and delayed-type hypersensitivity disease models［J］．Arthritis Rheum，2009，60 (2) : 380－389．

［53］L．Martinez-Lostao，F．Garcia-Alvarez，G．Basanez，et al．Liposome-bound APO2L/TRAIL is an effective treatment in a rabbit model of rheumatoid arthritis［J］．Arthritis Rheum，2010，62 (8) : 2272－2282．

［54］G．Schilders，W．V．Egberts，R．Raijmakers，et al．C1D is a major autoantibody target in patients with the polymyositis-scleroderma overlap syndrome［J］．Arthritis Rheum，2007，56 (7) : 2449－2454．

［55］A．Salama，N．Fichou，M．Allard，et al．MicroRNA-29b Modulates Innate and Antigen-Specific Immune Responses in Mouse Models of Autoimmunity［J］．PLoS One，2014，9 (9) : e106153．

Effects of Genistein Sodium Sulfonate(GSS) on ATPase Activities of Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

LI Xiao，XIE Jia-li，LAI Li-juan，LI Yu-lei，QIU Ping，LI Liang-dong，HUANG Zhi-hua，HUANG Cheng
(Basic Medical School of Gannan Medical Universty，Ganzhou，Jiangxi 341000)

Abstract:Objective: To investigate the effects of genistein sodium sulfonate (GSS) on the activities of Na+-K+-ATPase and Ca(2 +)-Mg(2 +)-ATPase in cerebral ischemia/reperfusion rat and explore its improvement effect on energy metabolism．

Key words:cerebral ischemia/reperfusion injury; genistein sodium sulfonate; energy metabolism

(收稿日期:2015－11－25) (責任編輯:敖慧斌) 2015－10－08) (責任編輯:敖慧斌)

通訊作者:黃志華，女，教授，碩士研究生導師，主要從事心腦血管疾病研究。E-mail: gnyxyhzh@163．com

*基金項目:國家自然科學基金項目(NO．31360250) ;江西省自然科學基金項目(NO．20114BAB205078) ;江西省教育廳科技項目(NO．GJJ12554) ;江西省衛生廳科技項目(NO．20121094)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．002

中圖分類號:R285．5

文獻標志碼:A

文章編號:1001－5779(2016) 01－0009－04

Methods: A rat cerebral ischemia/reperfusion injury was made through embolization of the middle cerebral artery．The neurological score was valued by using Longa grading method．The cerebral tissue was stained by using the TTC method，and the volume of infarction was investigated．The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2 +-Mg2 +-ATPase in brain tissue were measured by using Enzyme activity analysis assay．Results: MCAO model rats showed significant injury in neurological function and infarction volume，and reductions in the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2 +-Mg2 +-ATPase．After treated with GSS，the neurological score and volume of infarction were decreased，while the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2 +-Mg2 +-ATPase were increased．Conclusion: GSS has certain therapeutic effects on cerebral ischemia/reperfusion injury because it enhances brain energy metabolism．