苦蕎茶多糖超聲波提取工藝優化及組成分析

楊紅燕，趙志壯，商慶超，吳潔，楊興斌，董玲

1(第四軍醫大學 航空航天醫學系，陜西 西安， 710032)　2(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710119)　3(第四軍醫大學 學員旅，陜西 西安， 710032)

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苦蕎茶多糖超聲波提取工藝優化及組成分析

楊紅燕1,2，趙志壯3，商慶超3，吳潔3，楊興斌2，董玲1*

1(第四軍醫大學 航空航天醫學系，陜西 西安， 710032)2(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710119)3(第四軍醫大學 學員旅，陜西 西安， 710032)

摘要探討超聲波輔助對苦蕎茶多糖(tartary buckwheat tea polysaccharide ，TBTP)提取時間、液固比、溫度和提取率的影響。文中采用中心組合實驗(box-behnken design，BBD)優化TBTP提取工藝；使用高效液相色譜(HPLC)分析TBTP單糖組成。實驗結果表明：在超聲功率300 W時，提取3次，TBTP最優提取條件為溫度59.21 ℃、液固比24.72∶1(mL∶g)、提取時間74.30 min，且此時TBTP提取率為8.26%。HPLC結果表明，TBTP單糖組成分別為D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖，相對摩爾百分比分別為4.47%、3.09%、8.55%、2.52%、6.28%、22.08%、12.49%、26.88%、13.64%。表明超聲波輔助提取作為TBTP提取改良技術，顯著提高TBTP提取率、降低工藝成本，是一種良好的TBTP提取方法。

關鍵詞苦蕎茶；多糖；中心組合實驗(BBD)；高效液相色譜(HPLC)

苦蕎(Fagopyrumtataricum(L.) Gaertn)是一種蓼科蕎麥屬雙子葉植物，又名韃靼蕎麥(tartary buckwheat)，為1年生或多年生宿根性植物[1-2]。因其喜高寒，主要分布在西南和華北等高寒山區。苦蕎茶是將苦蕎種子苦蕎米經過篩選、烘烤等工序加工而成的天然植物沖飲品[3]。研究發現，苦蕎茶中除含有黃酮、蘆丁、葉綠素、粗蛋白及多種微量元素外富含苦蕎茶多糖(tarlary buckuheat tea polysaccharide,TBTP)。天然植物多糖是一類具有生物活性的大分子物質，其結構復雜，具有增強機體免疫力、抗腫瘤、降血脂、降血糖等作用[1]。為闡明TBTP對人體功能調控，首先需要提取TBTP。但是傳統水提醇沉法提取多糖，耗時長、提取率低，制約多糖研究和開發利用[6-8]。超聲波(頻率高于2萬Hz的聲波)具有方向性好、穿透能力強、易于獲得能量且在水中傳播衰減小等特點，在醫學、工業、農業、食品生產中有廣泛應用前景[9-15]。本實驗采用四川涼山黑苦蕎茶作為研究對象，利用超聲波輔助提取法獲得TBTP，并對該工藝進行優化及分析了TBTP單糖組分。

1試劑與儀器

1.1實驗試劑

黑苦蕎茶，購自四川西昌市滋元食品有限公司；超純水，實驗室自制；無水乙醇，天津市天力化學試劑有限公司；苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，北京化學試劑公司；D-甘露糖 (Man)、D-核糖 (Rib)、L-鼠李糖 (Rha)、D-葡萄糖醛酸 (Glcua)、D-半乳糖醛酸 (Galua)、D-葡萄糖 (Glc)、D-木糖 (Xyl)、D-半乳糖 (Gal)、L-阿拉伯糖 (Ara)、D-巖藻糖 (Fuc)，均購自美國 Sigma 公司；三氟乙酸 (TFA)和三乙胺(TEA)，購自德國 Merck公司；色譜甲醇和乙腈，購自美國 Honeywell 公司。

1.1實驗儀器

200 g多功能粉碎機，西安金振機械設備有限公司；標準檢驗篩(60目)，浙江上虞市道墟張興紗篩廠；藥物電子天平(SL202N)型，上海明橋精密科學儀器有限公司；HH-6B數顯恒溫水浴鍋，杭州大衛科教儀器有限公司；KQ-300DE型數控超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；LD4-2低速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環水多用真空泵，上海比朗儀器有限公司；RE-2 000A旋轉蒸發器，杭州大衛科教儀器有限公司；透析袋，華美生物工程公司；超純水儀，MILLI-Q MILLIPORE公司；冷凍干燥設備，EZ-DRY杭州大衛科教儀器有限公司；微量移液器，大龍公司；全波長酶標儀，美國熱電公司；高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司。

2實驗方法

2.1TBTP提取

2.1.1TBTP提取工藝流程[9]

苦蕎茶→粉碎→脫脂→超聲提取→離心收集上清液→濃縮水提液→醇沉→除蛋白→透析→冷凍干燥→TBTP

2.1.2多糖提取率的計算[公式(1)][14]

(1)

式中：mA為凍干樣品質量；mB為樣品質量。

2.2單因素實驗[9,16-20]

在超聲輔助熱水提取TBTP過程中，影響得率主要因素有：超聲波功率、提取次數、溫度、液固比和時間。本實驗采用2.1.1方法，以TBTP得率為指標，通過以下方法研究5因素對TBTP得率影響。

2.2.1提取次數對TBTP得率影響

在超聲波功率300W、溫度60 ℃、液固比20∶1(mL∶g)、提取時間50min的條件下，設定超聲輔助熱水浸提次數分別為1次、2次、3次、4次、5次，研究提取次數對TBTP得率影響。

2.2.2超聲波功率對TBTP得率影響

在溫度60 ℃、液固比20∶1、提取時間50min、提取3次的條件下，設定超聲波功率分別為200、250、300、350、400W，研究超聲波功率對TBTP得率影響。

2.2.3提取溫度對TBTP得率影響

在超聲波功率300W、液固比20∶1、提取時間50min、提取3次的條件下，設定浸提溫度分別為30、40、50、60、70 ℃，研究溫度對TBTP得率影響。

2.2.4液固比對TBTP得率影響

在超聲波功率300W、浸提溫度60 ℃、提取時間50min、提取3次的條件下，設定液固比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，研究液固比對TBTP得率影響。

2.2.5提取時間對TBTP得率影響

在超聲波功率300W、浸提溫度60 ℃、液固比25∶1、提取3次的條件下，設定浸提時間分別為10、30、50、70、90min，研究時間對TBTP得率影響。

2.3中心組合實驗提取TBTP

根據單因素實驗結果，以影響TBTP得率的主要因素為變量，多糖得率為響應值，采用BBD實驗設計方法[21-24]，對超聲波輔助提取TBTP工藝參數進行優化。

2.4數據處理

采用DesignExpert8.0.6統計軟件進行數據分析。

2.5HPLC分析TBTP單糖組成[25]

2.5.1色譜條件

流動相A為純乙腈；B由0.45gKH2PO4、0.5mLTEA、100mL乙腈和900mL超純水組成 (pH7.5)。色譜柱：VenusilC18柱(250mm× 4.6mmID, 5μm)； 梯度洗脫： 0min， 94%B； 4min，94%B；5min， 88%B； 30min，88%B。進樣量10μL，流速1.0mL/min，檢測波長為 250nm，柱溫為 35 ℃。

2.5.2單糖標準品制備

精密稱取一定量10種單糖，分別用體積分數10%甲醇溶液配成0.1mol/L母液。取適量母液梯度稀釋成5個不同濃度系列單糖溶液。取對應相同濃度10種單糖溶液各10μL混合，依次加入0.5mol/LPMP甲醇溶液200μL和0.3mol/LNaOH溶液300μL。混勻后在70 ℃水浴反應60min，冷至室溫，用0.3mol/LHCl溶液300μL中和。加入三氯甲烷1.0mL萃取，振蕩、離心，吸棄下層，重復3次。取上層水相加蒸餾水稀釋至適當濃度，0.45μm微孔濾膜過濾。

2.5.3多糖樣品制備

取TBTP20mg溶解在裝有2.0mLTFA(3.0mol/L)溶液的安瓿瓶中充氮氣封口，并在95 ℃水解8h后冷卻至室溫，冷卻后，樣品1 000r/min離心5min，上清液轉至5.0mL圓底燒瓶減壓蒸干后加1.0mL超純水溶解。取水解液樣品100μL，按“單糖標準品制備”方法制備樣品PMP標記物。

2.5.4單糖相對摩爾百分比測定

以測得各種單糖峰面積(y)與相應物質的量濃度(x)進行線性回歸，制作標準曲線，獲得回歸方程。記錄TBTP各單糖峰面積，應用回歸方程計算得TBTP中各單糖相對摩爾百分比。

3結果與分析

3.1單因素實驗結果

3.1.1提取次數的選擇

提取次數對TBTP得率影響實驗，結果如圖1所示。隨著提取次數增加，TBTP提取率顯著升高，但是當提取達到3次后，提取率增加趨于平緩。一方面，可能由于樣品中多糖已基本提取得到；另一方面，雖然隨著提取次數增加，溶解獲得多糖總量升高，但是相應后續操作量、溶劑和能量消耗也增多，使得實驗過程多糖損耗增大，總體多糖提取率沒有明顯升高，趨于平緩。故綜合多糖提取率和后續處理成本選擇提取次數為3次。

圖1　提取次數對TBTP得率的影響Fig. 1　Effect of extraction times on extraction yield of TBTP

3.1.2超聲波功率的確定

超聲波功率對TBTP得率影響實驗，結果如圖2所示。當超聲波功率<300 W時，隨著功率增大，提取率逐漸升高，說明超聲波確實可以提高TBTP提取率；但是當功率>300 W時，隨著超聲波功率增大，提取率反而下降，可能由于大功率物理剪切作用使多糖糖苷鍵被打斷，多糖結構破壞，后處理造成損失，多糖提取率降低[14,26]。因此根據實際生產需求和技術條件，選擇超聲波功率為300 W。

圖2　超聲波提取功率對多糖提取率的影響Fig.2　Effect of ultrasonic power on extraction yield of TBTP

3.1.3提取溫度的選擇

溫度對TBTP得率的影響如圖3所示。當溫度<60 ℃時，隨著溫度升高，提取率逐漸增大；而當溫度>60 ℃時，隨著溫度升高，提取率開始降低，可能當溫度過高時，苦蕎茶粉發生糊化等變化，導致多糖提取率降低。因此，選擇50～70 ℃進行參數優化。

圖3　提取溫度對TBTP得率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on extraction yield of TBTP

3.1.4液固比的確定

液固比對TBTP得率的影響如圖4所示。隨著液固比增大，提取率逐漸升高；但是當液固比達到25∶1后，隨著液固比升高，提取率變化趨于平緩。可能隨液固比增加，雖然溶解出多糖總量升高，但是總多糖溶液體積也增大，后續濃縮操作量變大，提取損耗增加，造成多糖提取率沒有明顯升高。故選擇固液比20∶1～30∶1進行參數優化。

圖4　液固比對TBTP得率的影響Fig.4　Effect of water/material ratio on extraction yield of TBTP

3.1.5提取時間的選擇

時間對TBTP得率的影響如圖5所示。

圖5　提取時間對TBTP得率的影響Fig.5　Effect of extraction time on extraction yield of TBTP

隨著提取時間延長，多糖溶解趨于充分，提取率逐漸增大；當時間達到70 min后，隨著提取時間延長，長時間超聲處理可能對多糖結構造成破壞，影響目標多糖含量，提取率下降。因此，選擇提取時間50～90 min進行參數優化。

3.2中心組合實驗優化TBTP提取工藝

中心組合設計因素與水平表、中心組合實驗設計方案與結果如表1、表2所示。共17組實驗，其中13～17為中心實驗，用來估計實驗誤差，其余為析因實驗；實驗回歸方程方差分析如表3所示。一次項X1、X3，交叉項X1X2、X1X3、X2X3，二次項X12、X22、X32均具有顯著性。對響應值和各因素進行回歸擬合[15,17]，得到回歸方程。

表1　中心組合設計因素與水平表

表2　中心組合實驗方案及結果

表3　回歸方程方差分析表

注：**差異極顯著(P<0.01)，*差異顯著(P<0.05)。

多糖提取率/%=8.20+0.37X1+0.052X2-0.54X3-0.38X1X2-0.53X1X3+0.48X2X3-1.08X12-1.46X22-4.30X32

根據回歸模型得：在超聲功率300 W、提取3次時，TBTP最優提取工藝為提取時間74.30 min、液固比24.72∶1、溫度59.21 ℃，且在此條件下TBTP提取率為8.26%。在優化條件下進行3次平行驗證實驗，結果表明，TBTP提取率穩定于(8.26±0.21)%。采用Design Expert 8.0.6統計軟件處理得響應面分析結果(如圖6所示)，時間分別與液固比和提取溫度有極顯著交互作用，同時，液固比與提取溫度交互作用也極顯著。該結果與表3方差分析結果一致。與普通熱水(80℃，2 h)浸提相比，該工藝不僅縮短了提取時間，降低了提取溫度，而且提取率由3%左右[3,14]提升到目前8.26%，增加2.75倍，說明該工藝對提高TBTP提取率作用效果明顯。

3.3TBTP單糖組成

如圖7所示，標準品HPLC色譜圖(A)中有10種標準單糖色譜峰，而樣品HPLC色譜圖(B)中1-9號位單糖峰均出現。且它們分別為D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖，在樣品中相應摩爾百分比分別為4.47%、3.09%、8.55%、2.52%、6.28%、22.08%、12.49%、26.88%、13.64%。同時，樣品中還有少數未知吸收峰。

4結論

研究發現TBTP在超聲波功率300W、提取3次時，最優工藝是提取時間74.30 min、液固比24.72∶1(mL∶g)、溫度59.21℃，TBTP提取率為8.26%。與普通熱水(80℃，2 h)浸提法相比，使用超聲波輔助提取，不僅縮短了提取時間、降低提取溫度，而且提取率由3%左右提升到目前8.26%，增加2.75倍，說明該工藝對TBTP提取有明顯效果。HPLC對TBTP單糖組成分析，結果表明TBTP單糖組成主要為D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖，且相應摩爾百分比分別為4.47%、3.09%、8.55%、2.52%、6.28%、22.08%、12.49%、26.88%、13.64%。同時，含有少量未知單糖。雖然所用超聲頻率在安全許可范圍內，明顯提高多糖提取率，但該方法是否對所得多糖結構和成分，如單糖組成等造成影響，目前還沒有相關報道，故后期可針對該方面進行進一步研究。

圖6　各因素交互作用的等高線圖和響應面圖Fig.6　Contour and response surface graphs for the interactive effect betweenthree factors

1-Man甘露糖;2-Rib核糖;3-Rha鼠李糖;4-Glcua葡萄糖醛酸;5-Glaua半乳糖醛酸;6-Glc葡萄糖;7-Xyl木糖;8-Gal半乳糖;9-Ara阿拉伯糖;10-Fuc巖藻糖圖7　混合標準單糖(A)與樣品(B)PMP衍生物的 HPLC 圖Fig.7　HPLC chromatogram of PMP derivatives of mixed standard monosaccharides and TBTP hydrolysis products

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Box-Behnken design for ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from tartary buckwheat tea and analysis its monosaccharide composition

YANG Hong-yan1,2, ZHAO Zhi-zhuang3, SHANG Qing-chao3, WU Jie3,YANG Xing-bin2, DONG Ling1*

1(Department of Aerospace Medicine, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)2(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China)3(Cadet Brigade of The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

ABSTRACTUltrasonic assistant extraction of tartary buckwheat tea polysaccharide ( TBTP) was studied. The effect of ultrasound on the extraction time, liquid-solid ratio, temperature, and extraction rate of TBTP was optimized by Box-Behnken Design (BBD). Then TBTP monosaccharide composition was analyzed with HPLC. It showed that when the ultrasonic power is 300 W and the extraction times, temperature, liquid-solid ratio and time of TBTP is 3, 59.21 ℃, 24.72∶1, 74.30 min, the extraction yield of was TBTP was 8.26%. The composition of TBTP are D-Man, D-Rib, L-Rha, D-Glcua, D-Glaua, D-Gla, D-Xyl, D-Gal, L-Ara and the relative molar percentage of these monosaccharide by HPLC were 4.47%, 3.09%, 8.55%, 2.52%, 6.28%, 22.08%, 12.49%, 26.88%, 13.64%, respectively. This study indicates that ultrasonic assistant is an improvement technology for extracting TBTP.

Key wordstartary buckwheat tea; polysaccharide; BBD; HPLC

收稿日期：2015-08-05，改回日期：2015-09-13

基金項目：國家自然科學基金項目(No.81470412)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603041

第一作者：碩士研究生(董玲副教授為通訊作者,E-mail:dongling@fmmu.edu.cn)。