銀杏黃酮對心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌保護作用及其作用機制研究

趙艷榮，張國斌，邴飛虹

430000湖北省武漢市，武漢道一堂中醫醫院(趙艷榮，邴飛虹)；河南中醫學院藥學院(張國斌)

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·論著·

銀杏黃酮對心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌保護作用及其作用機制研究

趙艷榮，張國斌，邴飛虹

430000湖北省武漢市，武漢道一堂中醫醫院(趙艷榮，邴飛虹)；河南中醫學院藥學院(張國斌)

【摘要】目的 探討銀杏黃酮對心肌缺血再灌注(MI/R)損傷大鼠的心肌保護作用及其作用機制。方法將80只大鼠隨機分為假手術組、模型組、銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組，各20只。采用左冠狀動脈前降支結扎30 min再灌注2 h的方法制備MI/R損傷模型，假手術組開胸但不結扎冠狀動脈，腹腔注射等體積1%二甲基亞砜(DMSO)；模型組制備MI/R損傷模型，腹腔注射等體積1% DMSO；銀杏黃酮低劑量組制備MI/R損傷模型，腹腔注射100 mg/kg銀杏黃酮10 ml/kg；銀杏黃酮高劑量組制備MI/R損傷模型，腹腔注射200 mg/kg銀杏黃酮10 ml/kg。4組大鼠均于術前1周開始給藥，1次/d。再灌注成功后處死各組大鼠，并比較4組大鼠心肌梗死面積、心肌組織髓過氧化物酶(MPO)活性及心肌組織核轉錄因子κB(NF-κB)和細胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達情況。結果模型組大鼠心肌梗死面積占心室總面積的百分比高于銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組(P<0.05)；銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌梗死面積占心室總面積的百分比比較，差異無統計學意義(P>0.05)。模型組、銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌組織MPO活性高于假手術組，模型組大鼠心肌組織MPO活性高于銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組(P<0.05)；銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌組織MPO活性比較，差異無統計學意義(P>0.05)。模型組、銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌組織ICAM-1陽性區面積所占百分比和NF-κB陽性區面積所占百分比高于假手術組，模型組大鼠心肌組織ICAM-1陽性區面積所占百分比和NF-κB陽性區面積所占百分比高于銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組(P<0.05)；銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌組織ICAM-1陽性區面積所占百分比和NF-κB陽性區面積所占百分比比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結論銀杏黃酮對MI/R損傷大鼠心肌具有保護作用，其作用機制可能與抑制中性粒細胞浸潤、下調NF-κB和ICAM-1表達有關，而與銀杏黃酮劑量可能無關。

【關鍵詞】心肌再灌注損傷；銀杏黃酮；大鼠；藥理作用分子作用機制

趙艷榮，張國斌，邴飛虹.銀杏黃酮對心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌保護作用及其作用機制研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2016，24(3)：38-42.[www.syxnf.net]

Zhao YR，Zhang GB，Bing FH.Cardioprotective effects of ginkgetin on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats and the action mechanism[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(3)：38-42.

銀杏黃酮(ginkgetin)系中藥銀杏葉的活性成分，具有抗炎、抗氧化、擴張血管、抑制血小板聚集及神經保護等藥理作用[1-3]。有研究顯示，銀杏黃酮對缺血再灌注心肌具有保護作用[4]，但其具體作用機制目前尚未明確。本研究擬制備心肌缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)損傷大鼠模型，以細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和核轉錄因子κB(NF-κB)為切入點，旨在探討銀杏黃酮對MI/R損傷大鼠的心肌保護作用及其作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物SD大鼠40只，雌雄各半，平均體質量(200±20)g，由華中科技大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2010-0009。

1.2主要藥品和試劑銀杏黃酮(黃酮含量≥24%)由西安潤堡生物科技有限公司提供，以1%二甲基亞砜(DMSO)配成所需濃度(100 mg/kg和200 mg/kg)；氯化硝基四氮唑藍(NBT)、髓過氧化物酶(MPO)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；NF-κB p65多克隆一抗、過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗、ICAM-1多克隆抗體試劑盒、鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)法免疫組織化學試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1分組將80只大鼠隨機分為假手術組、模型組、銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組，各20只。假手術組開胸但不結扎冠狀動脈，腹腔注射等體積1% DMSO；模型組制備MI/R損傷模型，腹腔注射等體積1% DMSO；銀杏黃酮低劑量組制備MI/R損傷模型，腹腔注射100 mg/kg銀杏黃酮10 ml/kg；銀杏黃酮高劑量組制備MI/R損傷模型，腹腔注射200 mg/kg銀杏黃酮10 ml/kg。4組大鼠均于術前1周開始給藥，1次/d。

1.3.2制備MI/R損傷模型采用冠狀動脈結扎手術制備模型，在參考文獻[5]方法的基礎上加以改進，具體如下：取動物，術前12 h禁食不禁水，麻醉后仰位固定，四肢連接ECG-1350P型十二導聯心電圖機。頸部做氣管插管，連接DW-3000型動物人工呼吸機(潮氣量為20 ml/kg，呼吸頻率為60次/min)，于胸骨左旁第3、4肋間開胸，并撐開肋骨暴露心臟，將帶線縫合針沿左心耳下緣冠狀動脈前降支起始部約4 mm處穿過，進針深度約1 mm，置入一段直徑為1.5 mm的乳膠管于縫合線下，然后結扎縫合線以造成心肌缺血。缺血約30 min觀察到心電圖T波高聳或ST段明顯抬高后，松開縫合線再灌注2 h，觀察到高聳的T波下降或抬高的ST段下降1/2以上即說明再灌注成功。

1.4觀察指標再灌注成功后處死各組大鼠，并觀察各組大鼠心肌梗死面積、心肌組織MPO活性及心肌組織NF-κB和ICAM-1表達情況。

1.4.1心肌梗死面積的檢測方法每組隨機選10只大鼠，取心臟，去除心房及脂肪組織，在冠狀動脈結扎線下從心尖起將心室平行切成厚度相等的5片，置于0.1% NBT溶液37 ℃下染色15 min，正常心肌呈藍色，梗死心肌呈灰白色。采集圖像，通過Image-Pro Plus 7.0圖像處理軟件測算梗死區面積和心室總面積，并計算心肌梗死面積占心室總面積的百分比[6]。

1.4.2心肌組織MPO活性的檢測方法取各組剩余10只大鼠部分心臟，0.9%氯化鈉溶液清洗后，上自動勻漿機制成勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液，采用比色法于Biomate-5型分光光度計460 nm下測定OD值，并計算MPO活性，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.3心肌組織NF-κB和ICAM-1表達的檢測方法取各組剩余10只大鼠心臟，0.9%氯化鈉溶液清洗后，在冠狀動脈結扎線下取心肌行冰凍切片，厚度8 μm，采用免疫組化法檢測NF-κB和ICAM-1表達情況，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，以PBS代替一抗作為陰性對照。采集圖像，采用Image-Pro Plus 7.0圖像處理軟件分析圖像，其陽性追蹤點為表達于細胞質或細胞核的棕黃色顆粒狀物，并測量陽性染色區面積，結果以陽性區面積所占百分比(陽性染色區面積/視野面積)表示。

2結果

2.1心肌梗死面積占心室總面積的百分比假手術組大鼠心肌梗死面積占心室總面積的百分比為0，模型組大鼠心肌梗死面積占心室總面積的百分比為(39.87±7.23)%，銀杏黃酮低劑量組大鼠心肌梗死面積占心室總面積的百分比為(33.60±6.05)%，銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌梗死面積占心室總面積的百分比為(31.54±7.92)%。4組大鼠心肌梗死面積占心室總面積的百分比比較，差異有統計學意義(F=3.37，P<0.05)；其中模型組大鼠心肌梗死面積占心室總面積的百分比高于銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)；銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌梗死面積占心室總面積的百分比比較，差異無統計學意義(P>0.05，見圖1)。

圖1　4組大鼠心肌梗死面積占心室總面積的百分比比較

Figure1Comparisonofpercentageofmyocardialinfarctarea/totalventricleareaamongthefourgroups

2.2心肌組織MPO活性假手術組大鼠心肌組織MPO活性為(76.85±10.02)U/g，模型組大鼠心肌組織MPO活性為(460.55±92.78)U/g，銀杏黃酮低劑量組大鼠MPO活性為(350.16±71.21) U/g，銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌組織MPO活性為(344.63±50.42)U/g。4組大鼠心肌組織MPO活性比較，差異有統計學意義(F=65.21，P<0.05)；其中模型組、銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌組織MPO活性高于假手術組，模型組大鼠心肌組織MPO活性高于銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)；銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌組織MPO活性比較，差異無統計學意義(P>0.05，見圖2)。

注：MPO=髓過氧化物酶

圖24組大鼠心肌組織MPO活性比較

Figure 2Comparison of MPO activity of myocardial tissues among the four groups

2.3心肌組織ICAM-1和NF-κB表達情況4組大鼠心肌組織ICAM-1陽性區面積所占百分比和NF-κB陽性區面積所占百分比比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中模型組、銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌組織ICAM-1陽性區面積所占百分比和NF-κB陽性區面積所占百分比高于假手術組，模型組大鼠心肌組織ICAM-1陽性區面積所占百分比和NF-κB陽性區面積所占百分比高于銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)；銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌組織ICAM-1陽性區面積所占百分比和NF-κB陽性區面積所占百分比比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表1、圖3)。

本文要點：①藥物預處理通過直接激活機體自身保護機制或促進機體釋放生物活性物質而發揮心肌保護作用；②銀杏黃酮通過抑制中性粒細胞浸潤、下調NF-κB和ICAM-1表達而發揮心肌保護作用；③銀杏黃酮對MI/R損傷的心肌保護作用可能與用藥劑量無關。

Table 1Comparison of percentage of ICAM-1-，NF-κB-positive area/total myocardial tissue area among the four groups

組別只數ICAM-1陽性區面積所占百分比NF-κB陽性區面積所占百分比假手術組109.87±2.556.16±1.94模型組1038.45±10.20a65.79±15.40a銀杏黃酮低劑量組1026.03±9.01ab49.86±11.13ab銀杏黃酮高劑量組1020.17±3.66ab38.95±15.02abF值27.7443.10P值<0.001<0.001

注：ICAM-1=細胞間黏附分子-1，NF-κB=核轉錄因子κB;與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

注：ICAM-1=細胞間黏附分子-1，NF-κB=核轉錄因子κB

圖34組大鼠心肌組織ICAM-1和NF-κB陽性區面積所占百分比比較

Figure 3Comparison of percentage of ICAM-1-，NF-κB-positive area/total myocardial tissue area among the groups

3討論

藥物預處理對MI/R損傷的心肌保護作用機制為藥物直接激活機體自身保護機制或促使機體釋放生物活性物質，進而增強損傷心肌組織對缺血、缺氧的耐受[7]。本研究旨在觀察銀杏黃酮對MI/R損傷大鼠的心肌保護作用，結果表明銀杏黃酮能有效縮小心肌梗死面積，與陳健康等[4]研究結果相一致。有研究顯示，以中性粒細胞浸潤為主的炎性反應是導致MI/R損傷的重要原因之一[8]，MI/R損傷發生時激活的中性粒細胞聚集到心肌組織，通過一系列病理反應引起心肌細胞損傷及其功能喪失，如釋放細胞毒性產物及炎性遞質，直接損傷心肌；黏附于微循環，阻塞毛細血管，造成“無復流現象”；釋放氧自由基，增強脂質過氧化反應，導致內皮細胞功能障礙等[9]。據報道，抑制中性粒細胞浸潤能有兒降低MI/R損傷程度，因此抗中性粒細胞治療可能成為防治MI/R損傷的有效措施[10]。MPO是中性粒細胞特有的一種酶，且MPO活性可判斷中性粒細胞浸潤程度。本研究結果顯示，再灌注成功后，模型組、銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌組織MPO活性高于假手術組，模型組大鼠心肌組織MPO活性高于銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組，而銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌組織MPO活性間無差異。表明缺血再灌注損傷后心肌組織MPO活性明顯升高，提示中性粒細胞浸潤明顯；且銀杏黃酮可降低心肌組織MPO活性。

臨床研究表明，ICAM-1在MI/R損傷的病理機制中發揮著重要作用，正常情況下心肌細胞僅表達極少量的ICAM-1；但當MI/R損傷發生時，心肌細胞中ICAM-1表達量會成倍增加[11]，且心肌細胞中ICAM-1高表達可刺激中性粒細胞與血管內皮細胞黏附，介導中性粒細胞對心肌組織的浸潤，從而導致心肌細胞受損、凋亡[12]。據報道，ICAM-1的表達在MI/R損傷家兔再灌注120 min時開始升高，并與中性粒細胞浸潤程度相關[13]，因此ICAM-1可能成為防治心肌缺血疾病的一個理想靶點[14]。本研究結果表明，模型組、銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌組織ICAM-1陽性區面積所占百分比高于假手術組，模型組大鼠心肌組織ICAM-1陽性區面積所占百分比高于銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組，而銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌組織ICAM-1陽性區面積所占百分比間無差異。表明MI/R損傷后心肌組織ICAM-1表達明顯升高，且高、低劑量銀杏黃酮均可通過降低心肌組織ICAM-1的表達而減少中性粒細胞在心肌積聚，從而改善心肌灌注。

臨床研究表明，NF-κB可調控多種炎性相關蛋白基因的表達，正常情況下NF-κB以非活性狀態存在于細胞質中；當MI/R損傷發生時，NF-κB活化并進入細胞核，進而調控一系列炎性遞質基因的表達，如ICAM-1、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)等，以上炎性遞質又會進一步激活NF-κB，形成惡性循環[15]。據報道，MI/R損傷大鼠心肌組織NF-κB p65蛋白表達量于再灌注60 min時達高峰，再灌注120 min時依然維持在高水平[16]，可見NF-κB被激活后啟動多種炎性遞質的表達是MI/R損傷的重要機制之一。本研究結果顯示，模型組、銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌組織NF-κB陽性區面積所占百分比高于假手術組，模型組大鼠心肌組織NF-κB陽性區面積所占百分比高于銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組，而銀杏黃酮低劑量組和銀杏黃酮高劑量組大鼠心肌組織NF-κB陽性區面積所占百分比間無差異。表明MI/R損傷后心肌組織NF-κB p65蛋白表達明顯升高，且高、低劑量銀杏黃酮均可降低心肌組織NF-κB p65蛋白的表達。

綜上所述，銀杏黃酮對MI/R損傷大鼠心肌具有保護作用，其作用機制可能與抑制中性粒細胞浸潤、下調NF-κB和ICAM-1表達有關，而與銀杏黃酮劑量可能無關。

作者貢獻：趙艷榮負責實驗實施、資料收集整理、撰寫論文；張國斌負責實驗評估、資料收集、數據統計分析；邴飛虹負責實驗設計、論文審校并對文章負責。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：謝武英)

Cardioprotective Effects of Ginkgetin on Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury in Rats and the Action Mechanism

ZHAOYan-rong，ZHANGGuo-bin，BINGFei-hong.DaoyitangHospitalofTraditionalChineseMedicineofWuhan，Wuhan430000，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the cardioprotective effects of ginkgetin on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats and the action mechanism.MethodsA total of 80 rats were randomly divided into A group，B group，C group and D group，each of 20 rats.Myocardial ischemia/reperfusion injury model was made by 30-minute ligation of left anterior descending branch and 2-hour reperfusion，rats of A group received intraperitoneal injection of 1% DMSO without ligation of left anterior descending branch，of B group received intraperitoneal injection of 1% DMSO after the preparation of the model，of C group received intraperitoneal injection of 100 mg/kg ginkgetin(10 ml/kg)，of D group received intraperitoneal injection of 200 mg/kg ginkgetin(10 ml/kg).Rats of the four groups received intraperitoneal injection before 1 week of the preparation of the model，1 time per day.All of the rats were killed after successful reperfusion，percentage of myocardial infarct area/total ventricle area，MPO activity and percentage of ICAM-1-，NF-κB-positive area/total myocardial tissue area were compared among the four groups.ResultsThe percentage of myocardial infarct area/total ventricle area of B group was statistically significantly higher than that of C group，of D group，respectively(P<0.05)；while no statistically significant differences of percentage of myocardial infarct area/total ventricle area was found between C group and D group(P>0.05).The MPO activity of B group，of C group，of D group was statistically significantly higher than that of A group，respectively，and MPO activity of B group was statistically significantly higher than that of C group，of D group，respectively(P<0.05)；while no statistically significant differences of MPO activity was found between C group and D group(P>0.05).The percentage of ICAM-1-，NF-κB-positive area/total myocardial tissue area of B group，of C group，of D group was statistically significantly higher than that of A group，respectively，percentage of ICAM-1-，NF-κB-positive area/total myocardial tissue area of B group was statistically significantly higher than that of C group，of D group，respectively(P<0.05)；while no statistically significant differences of percentage of ICAM-1-，NF-κB-positive area/total myocardial tissue area was found between C group and D group(P>0.05).Conclusion Ginkgetin has certain cardioprotective effects on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats，the action mechanism is possibly correlated with inhibition of neutrephil infiltration，down-regulation of NF-κB and ICAM-1，is possibly not correlated with dose of ginkgetin.

【Key words】Myocardial reperfusion injury；Ginkgetin；Rats；Molecular mechanisms of pharmacological action

(收稿日期：2015-12-04；修回日期：2016-03-14)

【中圖分類號】R 542.2

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1008-5971.2016.03.011

通信作者：邴飛虹，430000湖北省武漢市，武漢道一堂中醫醫院；E-mail：bingfeihong@126.com

基金項目：國家自然科學基金(81102870)；湖北省民營中醫醫院重點專科項目(20140526)