頭花蓼對幽門螺桿菌生長及代謝相關基因的影響*＊?

任艷君，莫　非，張　姝，何　蕓，吳　瓊，謝小琴，趙書琴

(貴州醫科大學臨床檢驗教研室，貴州貴陽　550004)

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頭花蓼對幽門螺桿菌生長及代謝相關基因的影響*＊?

任艷君，莫非＊＊，張姝，何蕓，吳瓊，謝小琴，趙書琴

(貴州醫科大學臨床檢驗教研室，貴州貴陽550004)

［摘要］目的:觀察苗藥頭花蓼對幽門螺桿菌(H.pylori)生長代謝及其相關基因的表達的影響。方法:將H.pylori菌接種于不同濃度的頭花蓼培養基(頭花蓼終濃度分別為64、32、16、8、4、2、1及0.5 g/L)，測定無H.pylori菌生長時頭花蓼的最小抑菌濃度(MIC) ;將H.pylori菌接種于無頭花蓼培養基(對照組)和頭花蓼MIC培養基(頭花蓼組)培養36 h，每隔4 h采用用酶標儀檢測590 nm處的吸光度值，繪制H.pylori生長曲線;用實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)檢測2組H.pylori菌液生長代謝相關基因FrdA、FrdB、HyuA及Pfr的表達水平。結果:頭花蓼對H.pylori最低抑菌濃度MIC為4 g/L，頭花蓼組H.pylori生長曲線位于對照組之下，Real－time PCR結果顯示頭花蓼作用后，頭花蓼組生長代謝相關基因FrdA、FrdB、HyuA及Pfr基因mRNA均呈減弱趨勢，差異具有統計學意義(P＜0.05)。結論:頭花蓼在體外對H.pylori具有明顯抑制作用，可通過影響細菌生長代謝相關基因的表達來抑制H.pylori的生長。

［關鍵詞］螺桿菌，幽門;生長;頭花蓼;代謝;基因

＊＊通信作者E-mail: 354406804@ qq.com

網絡出版時間: 2016－02－23網絡出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.2009.032.html

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori.H.pylori)是革蘭陰性的微需氧細菌，能定植在人胃黏膜表面，可誘發多種胃部疾病［1］。95 %～100 %的十二指腸潰瘍患者及80 %的慢性胃炎患者與H.pylori感染有密切的關系，其感染程度與癥狀嚴重程度成正相關［2］。在抗H.pylori治療中，由于抗生素的濫用，耐藥問題日益突出［3］，尋找新的治療藥物尤為重要。苗藥頭花蓼為貴州特有，研究表明頭花蓼對多種細菌具有良好的抗菌效果［4］。本課題以頭花蓼為研究對象，觀察其對H.pylori生長代謝相關基因延胡索酸還原酶鐵硫亞基(FrdB)、延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基(FrdA)、非血紅素鐵蛋白(Pfr)及乙酰脲利用蛋白A(HyuA)表達水平的影響，觀察苗藥頭花蓼是否可影響H.pylori的生長周期，探討頭花蓼對H.pylori的抑菌機制。

1　材料與方法

1.1主要材料

H.pylori(ATCC700392)國際標準測序株購自美國菌種保藏中心，哥倫比亞瓊脂粉(CM0331B)和腦心浸液粉(CM0225)購自OXOID，無菌脫纖維羊血購于廣州蕊特生物科技有限公司。苗藥頭花蓼浸膏(13143)由原國家藥檢局新藥審評中心研究員王子厚教授提供。

1.2培養基的制備

1.2.1配制哥倫比亞血瓊脂稱取稱取哥倫比亞血瓊脂粉3.8 g，加入蒸餾水89 mL，121℃高壓滅菌15 min，待瓊脂冷卻至50～55℃時加入無菌脫纖維羊血10 mL、混合抗生素溶液(萬古霉素30 mg、多黏菌素B 20 mg、兩性霉素20 mg及TMP 25 mg，混合溶解于無菌雙蒸水100 mL。) 1 mL，充分混勻，傾倒于直徑為90 mm的無菌平皿中，使瓊脂厚度為3～4 mm，隨機取一板置于37℃恒溫箱內培養24 h做無菌試驗，其余放入4℃冰箱備用。

1.2.2配制液體培養基稱取腦心浸液粉3.8 g，用無菌雙蒸水90 mL將其溶解，121℃高壓滅菌15 min，冷卻后加入胎牛血清10 mL，分裝于無菌離心管中，置于4℃備用。

1.2.3配制含藥培養基稱取頭花蓼64 g于無菌蒸餾水100 mL中，配成濃度為640 g/L的頭花蓼溶液。于哥倫比亞血瓊脂中加入遞減體積的頭花蓼溶液，輕搖混勻，制備成不同濃度的含藥培養基，使其終濃度分別為64、32、16、8、4、2、1及0.5 g/L。

1.3測定頭花蓼最小抑菌濃度

采用三氣培養箱，微需氧環境(37℃、5% CO2、10% O2、85% N2)培養H.pylori 48～72 h，陽性且無其它菌污染者進行傳代增菌，并通過觀察其菌落形態，尿素酶、觸酶、氧化酶試驗以及革蘭染色進行菌株鑒定［5］;參照NCCLS標準，采用二倍瓊脂稀釋法［6］，刮取培養48～72 h的H.pylori接種于液體培養基中，將其稀釋至1×1011cfu/L，用無菌棉簽蘸取菌液均勻接種于不同終濃度的含藥培養基上，于37℃三氣培養箱中微需氧環境中培養72 h后觀察結果，以無H.pylori菌生長的最小的頭花蓼藥物濃度為最小抑菌濃度(MIC)。

1.4繪制H.pylori生長曲線

取生長于哥倫比亞血瓊脂上的H.pylori菌接種于液體培養基，用液體培養基稀釋至含菌量為1011～1012cfu/ L的菌懸液。參照文獻［7］方法，取10個無菌24孔板，每個板設置頭花蓼組及對照組，頭花蓼組依次加入液體培養基、5% H.pylori菌懸液、相應體積的頭花蓼溶液至其終濃度為MIC，對照組加入等體積的5% H.pylori菌懸液，用液體培養基定容至300 μL，每個組設置3個重復孔。瞬時離心混勻后置于37℃微需氧培養箱培養36 h。以液體培養基調零，每隔4 h取出一個24孔板用酶標儀測其各個孔在590 nm處的吸光度值。根據3次重復實驗數據求得OD590平均值，繪制H.pylori的生長曲線。

1.5檢測生長代謝相關基因mRNA

采用Trizol法分別提取頭花蓼組及對照組H.pylori的mRNA，用酶標儀對提取的mRNA進行測定，計算OD260/OD280比值和mRNA濃度。將mRNA反轉錄為cDNA，將gryB設為內參基因，FrdA、FrdB、HyuA、Pfr為目的基因。探針和序列由NCBI檢索，根據GenBank上已發表的序列，采用primer 5設計引物(表1)。反應條件為95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，重復40個循環，每組做3個生物重復。采用2－ΔΔCT法，對目標基因的表達差異進行分析。

1.6統計學方法

應用SPSS 17.5軟件對相關數據進行統計學分析，組間比較用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1　PCR的引物信息Tab.1 Primer information of PCR

2　結果

2.1 H.pylori生長曲線

頭花蓼組H.pylori生長曲線有明顯變化，細菌在對數期不能進入正常的生長高峰。頭花蓼組的生長曲線位于對照組之下，表明頭花蓼對H.pylori的生長有抑制作用，且主要抑制其對數生長期的細菌分裂。見圖1。

圖1　頭花蓼對H.pylori生長的影響Fig.1 Effect of Polygonum capitatum on the growth curve of H.pylori

2.2 mRNA的提取

提取的H.pylori RNA電泳圖譜顯示16sRNA，23sRNA條帶較清晰，亮度為1∶2，且OD260/OD280的比率均在1.8～2.0，表明提取的mRNA完整且無DNA與蛋白污染。

2.3 H.pylori生長代謝相關基因檢測

熒光定量PCR儀檢測頭花蓼組及對照組中H.pylori生長代謝相關基因FrdA、FrdB、HyuA、Pfr及內參基因gryB的熒光信號Ct值，通過融解曲線分析，結果顯示FrdA、FrdB、HyuA及Pfr的溶點溫度分別為81.5℃、82.5℃、80.0℃及80.5℃，融解曲線均為單峰，表明PCR擴增為特異性擴增，頭花蓼組H.pylori生長代謝相關基因FrdA、FrdB、HyuA、Pfr的mRNA表達均低于對照組，差異具有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2　頭花蓼組和對照組H.pylori生長代謝相關基因FrdB、FrdA、HyuA及Pfr表達Fig.2 The expression of FrdB，FrdA，HyuA and Pfr gene in the control group and experiment group

3　討論

目前H.pylori對抗生素的耐藥性日趨嚴重，探索新的理想的抗H.pylori藥物具有重要的現實意義。頭花蓼是一種傳統苗藥，含有沒食子酸、原兒茶酸乙酯、沒食子酸乙酯等11個化合物［8］，本課題組前期研究發現，頭花蓼具有抗炎抗菌的效果，但其相關機制尚不清楚。本試驗證明，頭花蓼對H.pylori標準株的MIC為4 mg/L，通過與其它抗H.pylori中藥進行比較，H.pylori對頭花蓼的敏感性明顯高于其它中藥(黃芩苷25～200 mg/mL;黃連素12.5 mg/mL)［9］，表明頭花蓼在抗H.pylori方面具有應用研究價值。生長曲線可反映微生物的群體生長規律［10］，通過生長曲線的變化可揭示藥物的抑菌效果，本研究發現，加入頭花蓼后H.pylori生長曲線發生了變化，說明頭花蓼中可能某些成份不利于H.pylori生長。

延胡索酸還原酶(FRD)是可將延胡索酸鹽轉為琥珀鹽酸的一種酶，是重要的微生物代謝為無氧呼吸的一部分，為H.pylori的無氧呼吸提供能量ATP，革蘭陰性菌及多數兼性厭氧革蘭陽性菌，都具有這種特性。這種酶含有四個亞基: FrdA、FrdB 、FrdC、FrdD，其中親水性的FrdA和FrdB亞基形成酶催化域，參與能量代謝。本實驗中，藥物作用后的FrdA、FrdB基因表達均下調，該結果與國外學者Haraguchi等［11］研究一致，再次驗證頭花蓼通過影響H.pylori的呼吸鏈而阻止細菌的能量代謝，抑制細菌的生長。此外，非血紅素鐵蛋白(Pfr)［12］、乙酰脲利用蛋白A(HyuA)在細菌的能量代謝中也有重要作用。Pfr是一類不含血紅素但含鐵的蛋白，保證H.pylori在缺乏鐵離子的惡劣環境中，維持H.pylori的氧化還原代謝和能量代謝。本研究結果顯示，頭花蓼作用H.pylori后，Pfr基因表達量下調，提示頭花蓼可通過影響H.pylori對鐵的利用，干擾H.pylori的氧化還原代謝和能量代謝功能，從而抑制了H.pylori的生長; HyuA可水解焦谷氨酸，而亮氨酰胺肽酶(LAP)則由于變構作用，具有廣泛的底物特異性，可水解多種氨基酸。這兩種蛋白酶可確保足夠的氨基酸從多肽中釋放。有文獻顯示，抑氨肽酶素b可通過抑制LAP的活性抑制H.pylori的生長［13］。本研究顯示，H.pylori經頭花蓼作用后，HyuA基因表達量下調，提示了頭花蓼通過影響H.pylori氨基酸的代謝，影響了其生長代謝過程。

4　參考文獻

［1］蔣玲，李雪，劉恩思，等.幽門螺桿菌的研究進展［J］.中國衛生檢驗雜志，2015(17) : 3015－3017.

［2］程紹海.幽門螺旋桿菌相關性慢性胃炎探討［J］.中國醫藥指南，2012(8) : 184－185.

［3］王志坤，劉啟泉，靳凌瑜，等.薏苡利濁清毒方合并奧美拉唑治療幽門螺旋桿菌相關性十二指腸潰瘍的臨床研究［J］，2011(8) : 1593－1595.

［4］張麗娟，王永林，王珍，等.頭花蓼活性組分化學成分研究［J］.中藥材，2012(9) : 1425－1428.

［5］李巖，葛林梅，楊佩滿，等.幽門螺桿菌的分離與鑒定［J］按摩與康復醫學，2012(1) : 4－5.

［6］曾祥吉，李東霞.中藥抑菌實驗方法的研究［J］.現代中西醫結合雜志，2011(2) : 518－520.

［7］Xia HX，English L，Keane CT，et al.Enhanced cultivation of Helicobacter pylori in liquid media［J］.Clin Pathol，1993(46) : 750－753.

［8］荊文光，趙葉，張開霞，等.頭花蓼水提取物化學成分研究［J］.時珍國醫國藥，2015(1) : 47－50.

［9］吳明慧，黃衍強，黃贊松，等.黃連素、大黃素、五味子及黃芩苷對幽門螺桿菌多重耐藥株的體外抑菌作用［J］.世界華人消化雜志，2013(30) : 3247－3251.

［10］劉世旺，徐艷霞，石宏武.酢漿草乙醇提取物對細菌生長曲線的影響［J］.北方園藝，2007(3) : 113－115.

［11］Haraguchi H，Tanimoto K，Tamura Y，et al.Mode of antibacterial action of retrochalcones from Glycyrrhiza inflate［J］.Phytochemistry，1998(1) : 125－129.

［12］Waidner B，Greiner S，Odenbreit S，et al.Essential role of ferritin Pfr in Helicobacter pylori iron metabolism and gastric colonization［J］.Infection and immunity，2002 (7) : 3923－3929.

［13］Dong L，Cheng N，Ming WW，et al.The leucyl aminopeptidase from Helicobacter pylori is an allosteric enzyme［J］.Microbiology，2005(151) : 2017－2023.

(2015－08－22收稿，2015－12－31修回)

中文編輯:戚璐;英文編輯:趙毅

Effect of Polygomun capitutam on Helicobacter Pylori Growth Metabolism Associated Gene

REN Yanjun，MO Fei，ZHANG Shu，HE Yun，WU qiong，XIE Xiaoqin，ZHAO Shuqin
(Department of Laboratory Science，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China)

［Abstract］Objective: To observe the effect of Polygonum capitatum on growth metabolism associated genes expression of H.pylori.Methods: H.pylori fungus was inoculated in varied Polygonum capitatum concentration medium (final concentration as 64，32，16，8，4，2，1 and 0.5 g/L) ; testing minimal inhibitory concentration (MIC) of Polygonum capitatum when no H.pylori grows; H.pylori fungus was inoculated in no-Polygonum capitatum (control group) and Polygonum capitatum MIC (Polygonum capitatum group) to cultivate for 36 h，and test Absorbance value of 590 nm in every 4 h by ELIASA; then draw the H.pylori growth curve; real-time fluorescence quantitative PCR was adopted to test expression level of growth metabolism associated genes FrdA，FrdB，HyuA and Pfr both groups H.pylori fungus solution.Results: the min MIC concentration of Polygomun capitutam on H.pylori was 4 g/L，growth curve of Polygomun capitutam H.pylori was below control group; Real-time PCR results showed that after Polygomun capitutam taking effect，growth metabolism associated genes of Polygomun capitutam group，mRNA of FrdA，FrdB，HyuA and Pfr gene were decreasing，differences had statistical significance (P＜0.05).Conclusion: Polygonum capitatum has obvious inhibitory effect on H.pylori in vitro，Polygonum capitatum can inhibit the growth of H.pylori by affecting the growth of growth metabolism related genes.

［Key words］Helicobacter pylori; growth; Polygonum capitatum; metabolism; gene

*［基金項目］貴州省科學技術基金［黔科合J字(2014) 2027號］;貴州省科技合作計劃［黔科合LH字(2015) 7417號］;貴州省衛生計生委科學技術基金(gzwjkj2015－1－1003) ;貴陽市科技局計劃項目［筑科合同(20141001)］

［中圖分類號］R961.1

［文獻標識碼］A

［文章編號］1000-2707(2016) 02-0175-04