雌、雄性大鼠局灶性腦缺血－再灌注早期腦損傷的研究*＊?

郭淑娟，王琮民

(1.邯鄲市中心醫院老年病科，河北邯鄲　056001; 2.河北工程大學附屬醫院神經內科，河北邯鄲　056000)

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雌、雄性大鼠局灶性腦缺血－再灌注早期腦損傷的研究*＊?

郭淑娟1，王琮民2＊＊

(1.邯鄲市中心醫院老年病科，河北邯鄲056001; 2.河北工程大學附屬醫院神經內科，河北邯鄲056000)

［摘要］目的:研究性別對局灶性腦缺血－再灌注大鼠早期腦損傷的影響。方法:隨機取雌、雄健康SD大鼠各12只，分別記為F組和M組，采用栓線法制作大鼠中動脈栓塞模型，于缺血2 h再灌注24 h后斷頭取腦，采用TTC染色并測量各組大鼠腦梗死體積，采用新型熒光探針H2DCF-DA監測大鼠腦內活性氧自由基(ROS)陽性細胞數目并檢測平均熒光強度。結果:缺血2 h再灌注24 h內，F組和M組大鼠的死亡率分別為8.33 %和16.77 %，差異無統計學意義(P＞0.05) ; TTC染色顯示，F組腦梗死體積為(21.42±3.54) %，M組為(40.01± 4.92) %，F組小于M組(P＜0.05) ; H2DCF-DA染色顯示，F組和M組的腦缺血半暗帶區ROS陽性細胞數目分別為8.56±1.89和19.04±1.37，F組少于M組(P＜0.05)，平均熒光強度分別為20.58±0.89和39.25±1.41，F組少于M組(P＜0.05)。結論:雌鼠缺血－再灌注損傷在短期內較輕，其機制可能與雌性大鼠腦組織抑制氧自由基能力較強有關。

［關鍵詞］性別因素;腦缺血;腦梗死;體積;氧自由基

＊＊通信作者E-mail: qiierrsann@163.com

網絡出版時間: 2016－02－23網絡出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.1859.018.html

缺血性腦卒中一般是指由于腦動脈粥樣硬化引起血管腔狹窄或完全閉塞，導致局部腦血流中斷，腦細胞缺血缺氧軟化壞死的疾病。缺血性腦卒中的危害性大，治愈率低，嚴重影響患者的生活質量［1］。有報道指出，絕經前女性的腦卒中發病率低于同齡男性，而且對缺血損傷的耐受性高，但絕經后女性的腦卒中發生率顯著增加，提示雌激素水平變化與缺血性腦病的發生發展可能有一定關系［2］。有研究發現雌激素可促進卒中后的腦神經再生，有利于神經功能恢復［3］。以往多采用去卵巢或絕經的雌性大鼠觀察雌激素對缺血性腦卒中的影響［4－6］，但對同等損傷程度、正常生理激素水平及性別因素是否會對缺血性腦卒中產生影響，特別是缺血－再灌注短期內的影響鮮有報道，本實驗探討正常生理激素水平下性別對局灶性腦缺血－再灌注大鼠早期腦損傷的影響。

1　材料與方法

1.1試驗設備及試劑

呼吸機(CWE公司，美國)、DGD-300S雙極電凝(Sigma公司，美國)、反饋式溫度調節儀(CZ公司，美國)、透射電鏡(Olympus公司，日本)、BH-2手術顯微鏡(Olympus公司，日本)、高速離心機(Beckman公司，美國) ; TTC (上海恒遠公司)、H2DCFA-DA試劑盒(CWE公司，美國)，水合氯醛(10%)、磷酸二氫鈉等。

1.2試驗動物及模型制作

成年SD雌、雄大鼠各12只，分別記為F組和M組，體質量250～300 g，許可證號SYXK(冀) 2014－0038，采用標準配方飼料分籠飼養，室溫22 ～25℃，術前禁食，自由進水。大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3.5 μL/g)，取頸部正中切口，上切至頸與下頜反折處，下切至胸骨角，剪開闊筋膜，找左側頸總動脈(CCA)分叉、分離左側頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，結扎ECA遠心端，離斷，CCA和ICA用動脈夾夾閉，在ECA上剪“V”型口并將備好的栓線沿剪口插入，輕輕結扎，然后松ICA動脈夾，栓線調整角度順勢插入ICA，遇阻力停止，深度約為18 mm。將栓線與左側CCA結扎固定，移去CCA動脈夾，腦缺血模型制備成功。2 h后，將栓線從顱內輕輕拔出，從球端退至ECA止，剪掉多余的線并縫合皮膚，再灌注開始，記錄再灌注時間至24 h時止［7］。

1.3測定腦梗死體積

再灌注24 h時，大鼠腹腔注射過量10%水合氯醛麻醉，迅速斷頭，取完整全腦，－24℃冷凍30 min，從額極至枕極沿冠狀位切2 mm厚度切片6片，除第5片用于H2DCF-DA染色計數ROS細胞外，其余5片均浸泡于2% TTC染色液中，37℃溫箱中孵育20 min，每隔5 min翻動正反面，拍照，Imageplus5.0計算腦梗死體積。腦梗死體積百分比= (A－B) /A×100%，A為健側大腦半球體積= (A1+ A2+…A6)·h，B為梗死側非梗死區大腦半球體積= (B1+ B2+…B6)·h，A1為第1片切片健側腦組織面積，B1代表第1片梗死側非梗死區腦組織面積，h表示切片厚度［8］。

1.4測定活性氧自由基(ROS)陽性細胞數目

每個大鼠均取第5片腦切片用H2DCF-DA染色，按說明書操作，每張切片同等放大倍數拍照，借用NIS Element軟件，確定腦組織內的ROS陽性細胞數和其分布密度。

1.5統計學方法

用SPSS 20.0軟件進行數據分析，兩組死亡率比較用Fisher精確概率法，計量資料用均數±標準差(±s)表示，組間比較用單因素方差分析法，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1死亡率

腦缺血2 h再灌注24 h內，F組死亡1例，死亡率為8.33%; M組死亡2例，死亡率為16.77%。Fisher精確概率法假設檢驗分析，F組和M組大鼠的病死率無明顯差異，P =0.185。

2.2腦梗死體積

腦缺血2 h再灌注24 h時，經TTC染色，Imageplus5.0軟件分析顯示，F組腦梗死體積為(21.42±3.54) %，M組為(40.01±4.92) %，單因素方差分析顯示，F組大鼠的腦梗死體積小于M組，P =0.0013;如圖1所示紅色區域為正常組織，白色區域為梗死組織。

圖1　兩組腦缺血－再灌注大鼠腦梗死體積Fig.1 The infarction volume of ischemia reperfusion rats in F and M group

2.3缺血半暗帶區ROS陽性細胞

缺血2 h再灌注24 h時，H2DCF-DA染色顯示，F、M兩組大鼠的缺血半暗帶區均出現H2DCFDA陽性染色細胞，高倍顯微鏡下，可見胞體顯示綠色熒光，凸起清晰; NIS Element軟件測定并經單因素方差分析顯示，F組ROS陽性細胞數少于M 組(P＜0.05)，F組平均熒光強度低于M組(P＜0.05)，見表1及圖2。

表1　兩組大鼠缺血2 h再灌注24 h時ROS陽性細胞數和熒光強度(±s)Tab.1 ROS positive cell number and average fluorescent intensity after 2 h ischemia and 24 h reperfusion in two groups

表1　兩組大鼠缺血2 h再灌注24 h時ROS陽性細胞數和熒光強度(±s)Tab.1 ROS positive cell number and average fluorescent intensity after 2 h ischemia and 24 h reperfusion in two groups

組別　n ROS陽性細胞(個) 10　 8.56±1.89　 20.58±0.89 M組　10　 19.04±1.37　 39.25±1.41 P熒光強度F組＜0.05　　＜0.05

圖2　兩組大鼠缺血2 h再灌注24 h時ROS陽性細胞(H2DCF-DA，×500)Fig.2 H2DCF-DA fluorescence staining results of F and M group after ischemia reperfusion

3　討論

腦缺血尤其是再灌注發生后，由于缺血缺氧、鈣離子釋放增加和興奮性神經遞質的釋放，ROS生成增多，ROS清除酶如超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶會大量消耗，同時合成發生障礙。細胞抗氧化能力的下降，造成ROS的爆發性增長，引起線粒體呼吸功能喪失及細胞氧化應激損傷，加速神經元導致死亡。故及時移除過量的ROS可對腦缺血－再灌注損傷起到保護作用［9］。在急性腦梗死早期(一般為24 h內)，梗死中心區和正常腦區之間會有一個動態變化的區域，若血流再通，此區域可恢復為正常區域，腦梗死體積不再擴大，這個區域稱為缺血半暗帶區。目前，“挽救”缺血半暗帶區已成為缺血性腦卒中治療的新靶點［10］。本實驗結果表明，缺血2 h再灌注24 h時，雌性大鼠腦梗死體積明顯小于雄性。說明正常生理條件下，同等的損傷程度，雌激素對腦組織的保護能力高于雄激素。有研究發現，缺血－再灌注48 h時，正常雌性大鼠組的腦梗死體積明顯小于雄性大鼠組(P＜0.05)，但切除卵巢后的雌性大鼠和雄性大鼠的腦梗死體積差異不明顯(P＞0.05)［11］。Kong［12］通過建立頸動脈缺血模型發現，雌性大鼠組的腦損傷明顯小于雄性。臨床統計資料表明，雌激素可有效提高血管平滑肌功能，可降低低密度脂蛋白和提高高密度脂蛋白濃度。Schierbeck研究發現，男性的頸總動脈血管內膜厚度明顯低于同齡絕經前的女性，說明絕經前女性的血管富有彈性，血流狀態較好［13］。

H2DCF-DA是一種新型的熒光探針，其進入細胞后可被細胞內的ROS氧化而發綠色熒光，熒光強度與腦組織ROS生成量線性相關，其位置與ROS的生成位置一致，平均熒光強度值反映了ROS在腦組織中的分布密度。本實驗采用H2DCF-DA熒光技術測定大鼠ROS陽性細胞，結果表明，雌性組大鼠缺血半暗帶區ROS陽性細胞數目、平均熒光強度明顯小于雄性，說明生理水平條件下，雌激素抑制ROS生成的能力要高于雄激素，推測其可能與下列因素有關: (1)雌激素可以上調缺血－再灌注后的bcl-2表達［13］，缺血再灌注發生時，bcl-2可以抑制鈣離子釋放，降低興奮性氨基酸毒性釋放，從而減少ROS的生成［14］; (2)增加缺血區域的腦血流量，芩如萍等［15］通過建立局灶性腦缺血模型，證明雌激素可以改善灌注區的腦血流量，而血流量的增加有利于抗氧化物質的生成，從而對腦組織起到保護作用。

綜上，正常生理條件下，雌激素可以對腦缺血－再灌注損傷起到一定的保護作用，此保護作用與雌激素抑制ROS的生成有關。

4　參考文獻

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(2015－06－24收稿，2015－09－25修回)

中文編輯:周凌;英文編輯:劉華

The Influence of Gender on Early Cerebral Damage of Rats after Focal Ischemia Reperfusion

GUO Shujuan1，WANG Congmin2
(1.Department of Geriatrics，Handan Central Hospital，handan 056001，Hebei，China; 2.Department of Neurology，the Affiliated Hospital of Hebei Engineering University，Handan 056001，Hebei，China)

［Abstract］Objective: To investigate the influence of gender on early cerebral damage of rats after focal ischemia reperfusion.Methods: Twenty-four healthy SD rats were randomly divided into F and M groups，including 12 females and 12 males.The rats were subjected to MCAO for 2 h and killed after reperfusion 24 h.The cerebral infarction volume was determined by TTC staining，the intracerebral ROS positive cell number and average fluorescent intensity was monitored and detected by new fluorescent probe H2DCF-DA.Results: After 2 h ischemia and 24 h reperfusion，the rats mortality rates of F and M group were 8.33% and 16.77% respectively，the differences were not statistically significant (P＞0.05).TTC staining showed that the cerebral infarction volume in F group was (21.42±3.54) % while that in M group was (40.01±4.92) %，and the cerebral infarction volume in F group was significantly less than that in M group(P＜0.05).H2DCF-DA staining showed that cerebral ischemia half dark area of oxygen free radical positive cells number of F group 8.56±1.89 was significantly less than that of M group 19.04±1.37(P＜0.05).The average fluorescence intensity of ROS positive cell in F group 20.58±0.89 was significantly less than that of M group 39.25±1.41 (P＜0.05).Conclusion: The reperfusion injury in female rats is less serious in the short term，whose mechanism maybook=167,ebook=48be related to estrogen in brain of female rats inhibiting oxygen free radical.

［Key words］gender; cerebral ischemia; cerebral infarction; volume; oxygen free radical

*［基金項目］國家自然科學基金(81400934)

［中圖分類號］R741.02

［文獻標識碼］A

［文章編號］1000-2707(2016) 02-0166-04