肝細胞癌中胰島素樣生長因子1受體的表達及意義*＊?

余夢懿，成元華＊＊，申九妹，孫　博

(1.貴州醫科大學病理學教研室，貴州貴陽　550004; 2.廈門市中醫院病理科，福建廈門　361009; 3.貴州醫科大學，貴州貴陽　550004)

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肝細胞癌中胰島素樣生長因子1受體的表達及意義*＊?

余夢懿1，成元華1＊＊，申九妹2，孫博3

(1.貴州醫科大學病理學教研室，貴州貴陽550004; 2.廈門市中醫院病理科，福建廈門361009; 3.貴州醫科大學，貴州貴陽550004)

［摘要］目的:探討胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)在肝細胞癌(HCC)中的表達及意義。方法:采用免疫組織化學EnVision兩步法檢測HCC病例癌組織及配對癌旁組織中IGF-1R的蛋白表達，分析IGF-1R表達水平與HCC患者臨床病理特征及微血管密度(MVD)的關系，同時隨訪觀察不同IGF-1R表達水平或MVD計數HCC患者的復發、轉移及死亡率。結果: HCC癌組織中IGF-1R蛋白表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義(P＜0.05) ; IGF-1R高表達的HCC中，有血管浸潤、病理分級Ⅲ～Ⅳ級、臨床TNMⅡ～Ⅲ期患者人數多于IGF-1R低表達人數(P＜0.05) ;癌組織中MVD值明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(P＜0.001) ;經Spearman等級相關分析顯示IGF-1R蛋白表達水平與MVD計數呈正相關，IGF-1R高表達及MVD計數較高的HCC患者復發、轉移及死亡率也較高(P＜0.05)。結論: IGF-1R可促進HCC的復發、轉移，與促進腫瘤血管新生有關。

［關鍵詞］癌，肝細胞;胰島素樣生長因子1受體;免疫組織化學;微血管密度;基因表達

＊＊通信作者E-mail: chengyuanhua@ gmc.edu.cn

網絡出版時間: 2016－02－23網絡出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.1833.004.html

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的惡性腫瘤，全球每年新發病例約748 300例，死亡695 900例，我國發病和死亡患者數量約占全球50%［1－2］。有研究發現，HCC發生的分子機制與胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGFs)系統信號通路異常相關［3］。IGFs是一種多功能細胞增殖調控因子，在胚胎發育、中樞神經系統發育及腫瘤細胞增殖等方面具有重要的生物學功能。胰島素樣生長因子1受體(insulinlike growth factor 1 receptor，IGF-1R)在多種腫瘤中呈高表達，與腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移密切相關［4］。本研究應用免疫組化染色法檢測51例HCC患者癌組織及癌旁組織中IGF-1R蛋白表達情況并計數兩組中的微血管密度(microvessel density，MVD)，探討IGF-1R的表達與HCC臨床病理特征之間的關系。

1　材料與方法

1.1臨床資料

51例HCC病例癌組織及相應的癌旁組織為廈門市中醫院病理科2011年6月～2013年8月的石蠟包埋標本，所有切片均由兩位高年資病理醫師復查診斷;癌旁組織取自距腫瘤邊緣2 cm處的肝組織。采用國際抗癌聯盟(UICC)第六版制定的TNM分期標準，Ⅰ期9例、Ⅱ期13例、Ⅲ期29例及Ⅳ期0例。病理分級根據經典的Edmondson-Steiner＇s分級系統，Ⅰ級6例、Ⅱ級25例、Ⅲ級18例和Ⅳ級2例。

1.2方法

所有標本均經4%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，HE染色。免疫組織化學染色采用EnVision兩步法，一抗包括IGF-1R(美國Ventana公司，克隆號G11，即用型)、CD34(福州邁新生物技術開發有限公司，克隆號QBEnd/10，即用型，用于標記微血管)，每次實驗均設立相應的陽性對照，PBS液代替一抗作為空白對照。實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.3觀察指標

觀察51例HCC癌組織及癌旁組織IGF-1R陽性細胞、計數MVD值并隨訪。IGF-1R定位于細胞質，為棕黃色顆粒。每張切片于顯微鏡下隨機觀察10個高倍視野，計算陽性細胞的百分率，取其平均值。根據陽性細胞占視野細胞總數的百分率及其染色強度綜合評分進行判斷。(1)陽性細胞＜5% 記0分，5～25%記1分，26～50 %記2分，＞50%記3分。(2)按細胞染色強弱:不著色記0分，黃色記1分，棕黃色記2分，黃褐色記3分。兩種評分相加，0～1分為陰性，2分為弱陽性，3～4分為陽性，5～6分為強陽性。2分以上視為陽性表達，2～4分歸為低表達，5～6分歸為高表達［5］。MVD用抗體CD34標記的血管內皮細胞參照參考文獻［6］進行計數，在光鏡低倍視野下掃視整張切片尋找3個染色陽性的血管高密度集中的區域作為“熱點”，然后在光鏡200倍視野下計數微血管的數目，平均值即為該病例的MVD值。全部病例MVD值均以中位數分為低計數組與高計數組。并對患者的復發、轉移及生存率進行隨訪，平均隨訪時間29個月。

1.4統計學分析

數據應用SPSS19.0軟件分析處理。計量資料采用t檢驗，分類資料進行χ2檢驗，等級相關分析采用Spearman等級相關分析，單因素生存分析采用Kaplan-Meier法，差異的顯著性采用log-rank檢驗。P＜0.05差異有統計學意義。

2　結果

2.1 IGF-1R蛋白表達

在51例HCC中，癌組織IGF-1R蛋白高表達34例，低表達17例;在癌旁組織中IGF-1R蛋白高表達20例，低表達31例。IGF-1R高表達率在癌組織(34/51，66.7%)較癌旁組織(20/51，39.2%)高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1A、B; IGF-1R蛋白表達在有無血管浸潤、病理學分級及TNM分期組間比較，差異有統計學意義(P＜0.05) ;而在不同年齡、性別、飲酒史、HBsAg、AFP、腫瘤數目、腫瘤大小及是否合并肝硬化組間比較，差異無統計學意義(P＞0.05) ;見表1。

表1　HCC中IGF-1R蛋白表達與臨床病理特征的關系Tab.1　The correlation between the expression of IGF-1R protein and the clinicopathologic features in HCC

2.2 MVD計數

51例HCC病例中，以CD34標記的MVD在癌組織中計數為(231.57±110.65)明顯高于配對癌旁組織(146.08±64.68)，差異有統計學意義(P＜0.001)，見圖1C、D。MVD水平在有無血管浸潤、不同病理分級及TNM分期組間比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，在不同年齡、性別、飲酒史、HB-sAg、AFP、腫瘤數目、不同腫瘤大小及是否合并肝硬化組間比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。

A為HCC中IGF-1R強陽性表達(+ + +)，B為癌旁組織中IGF-1R弱陽性表達(+)，C為癌組織中CD34標記的微血管，D為癌旁組織中CD34標記的微血管圖1　HCC組織及癌旁組織中IGF-1R蛋白的表達和CD34標記的微血管(EnVision法，×200)Fig.1 The microvessel marked by CD34 in HCC(EnVision，×200)

2.3 MVD與IGF-1R表達的Spearman等級相關分析

在51例HCC中，MVD高計數組26例，低計數組25例;在26例MVD高計數的癌組織中IGF-1R蛋白呈高表達22例，低表達14例，經Spearman等級相關分析，顯示MVV與IGF-1R表達呈正相關(r =0.362，P =0.006)。

2.4隨訪情況

51例HCC中38例獲訪，隨訪率74.5%，隨訪時間16～42個月，平均隨訪時間29個月，其中19例復發，17例轉移，13例死亡，無腫瘤復發者19例。單因素生存分析結果顯示，IGF-1R蛋白高、低表達組間比較，復發率、轉移率及生存率差異均有統計學意義(P＜0.05)。MVD高計數組與低計數組比較，復發率、轉移率及生存率差異有統計學意義(P＜0.05) ;見表2。

表2　不同IGF-1R蛋白表達水平及MVD計數的HCC患者復發率、轉移率及死亡率Tab.2 The correlation between the expression of IGF-1R protein，the value of MVD and the follow-up data in HCC

3　討論

HCC病程進展快且預后很差［7］。肝臟是合成和分泌IGFs的主要器官［8］。研究顯示，IGF-1R蛋白是酪氨酸激酶蛋白，可以激活下游一系列細胞增殖和抗凋亡信號通路，誘導其分裂增殖，細胞的過度分裂增殖將大大增加腫瘤發生的概率，其表達的高低，在一定程度上決定了細胞的致瘤性或腫瘤細胞的轉移性，HCC患者機體由于對IGF-1R的抑制作用減弱或消失，使得IGF-1R過表達，造成腫瘤的發生［9］。Ohshima-Hosoyama等［10］通過抑制小鼠髓母細胞瘤模型的IGFs途徑，抑制了腫瘤生長。有研究認為，IGF-1R能以IGF-1和IGF-2作為主要的下游分子，通過不同途徑上調胰腺癌細胞中VEGF的表達，在促進腫瘤血管新生中起到重要作用［11］。成莉等［12］發現IGF-1R表達陽性的宮頸癌組織內MVD明顯高于IGF-1R表達陰性者，提示IGF-1R可以促進腫瘤血管形成。還有研究顯示IGF-1R不僅具有上調金屬基質蛋白酶及尿激酶型纖溶酶原活化因子的表達，促使細胞外基質降解，促進腫瘤細胞轉移的作用;也能通過促進腫瘤細胞內鈣黏蛋白、層黏連蛋白、纖黏連蛋白等黏附分子的形成，增加其對內皮及基底膜的黏附性，來促進腫瘤細胞轉移［13］。

本次研究發現，在51例HCC病例的癌組織中IGF-1R蛋白表達高于相應的癌旁組織，提示IGF-1R的高表達可能與HCC的發生有關，且與腫瘤的分期、分級、轉移、復發及生存率相關。牛堅等［14］應用免疫組化染色法檢測了36例原發性肝癌組織中IGF-1R的表達，結果顯示原發性肝癌組織中IGF-1R蛋白的陽性表達率顯著高于正常肝組織。本次研究發現，IGF-1R高表達患者發生血管浸潤人數(25例)多于低表達患者(4例)，病理分級Ⅲ+Ⅳ級人數(24例)多于低表達患者(7例)，TNM臨床分期Ⅱ+Ⅲ期人數(32例)多于低表達患者(10例)，提示IGF-1R表達水平與HCC的生物學行為有關，其在HCC的發病、轉移、復發機制中的作用值得探討。

阻斷腫瘤血管形成目前已成為臨床腫瘤治療研究的熱點，如何選擇有效的治療靶點以阻斷腫瘤新生血管形成還有待解決。本實驗顯示HCC中IGF-1R的蛋白表達強度與MVD水平呈正相關，但其因果關系值得探討。推測抑制HCC中IGF-1R的高表達能抑制腫瘤血管新生，IGF-1R有望成為阻斷HCC發生、發展過程中血管生成的有效靶點，這還需要進一步研究。

4　參考文獻

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(2015－11－12收稿，2015－12－31修回)

中文編輯:吳昌學;英文編輯:劉華

The Significance of Insulin-like Growth Factor 1 Receptor Expression in Hepatocellular Carcinoma

YU Mengyi1，CHENG Yuanhua1，SHEN Jiumei2，SUN Bo3
(1.Department of Pathology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China; 2.Department of Pathology，Traditional Chinese Medicine Hospital，Xiamen 361009，Fujian，China; 3.Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China)

［Abstract］Objective: To investigate the expression of insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) and the relationship between IGF-1R and the clinicopathologic features in hepatocellular carcinoma (HCC).Methods: Immunohistochemical Envision method was utilized to detect the expression of IGF-1R.MVD was marked by antibody CD34 and counted.The follow-up data of the cases of HCC was analyzed by Kaplan-Merier method for survival with log-rank test.Result: (1) The IGF-1R protein showed a higher expression in HCC than in the tumor-adjacent tissues，the difference was statistically significant(P＜0.05).(2) The difference of the number of IGF-1R protein overexpression in histological grade and TNM stage was significant(P＜0.05)，moreover，the vascular infiltration group was significantly more than group without vascular invasion (P＜0.05).But there was no significant difference between different tumor size，different gender，age，alcohol intake history，HBsAg，AFP，tumor number and with or without liver cirrhosis (P＞0.05).(3) The value of MVD was higher in HCC than that in tumor-adjacent tissues (P＜0.05).(4) By Spearman rank correlation analysis，the level of MVD was positively correlated with IGF-1R protein expression.(5) By survival analysis of the 38 cases of HCC with follow-up data，the difference in terms of the rate of recurrence，metastasis and survival rate between the group of the high and low expression of IGF-1R protein was significant(P＜0.05).book=151,ebook=32Conclusion: IGF-1R protein may promote the occurrence and development of HCC，and promote the neovasculation in HCC.The expression of IGF-1Rcan be used as a marker to evaluate the prognosis of HCC.

［Key words］carcinoma，hepatocellular; insulin-like growth factor 1 receptor; immunohistochemistry; vessel density; gene expression

*［基金項目］貴州省科學技術基金［黔科合J字KLG(2013) 27號］;貴州省科技計劃項目［黔科合SY字(2011) 3062號］;貴州省科學技術基金［黔科合J字(2009) 2187號］;貴陽市科學技術計劃項目［(2009)筑科農合同字第3－020號］

［中圖分類號］R735.7

［文獻標識碼］A

［文章編號］1000-2707(2016) 02-0150-05