解毒清肺合劑對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺組織中性粒細胞彈性蛋白酶及黏蛋白5AC表達的影響

陳英 馮淬靈 李根茂 葛東宇 王駿

摘要：目的 探討解毒清肺合劑調節慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道黏液高分泌的作用機制。方法 采用氣道滴注脂多糖聯合煙熏方法建立慢性阻塞性肺疾病模型。40只清潔級Wistar大鼠隨機分為空白對照組、模型組、解毒清肺組與克拉霉素組。模型組、解毒清肺組、克拉霉素組分別給予生理鹽水、解毒清肺合劑、克拉霉素灌胃，空白對照組正常喂養，連續30 d。實驗第31日，處死大鼠提取肺組織，每組隨機選取6只，HE染色觀察肺組織病理形態及黏液腺體增生，實時熒光定量PCR檢測各組大鼠肺組織中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）、黏蛋白5AC（MUC5AC）mRNA表達，免疫組化檢測肺組織及氣道上皮NE、MUC5AC蛋白表達。結果 與空白對照組比較，模型組氣道上皮黏液腺體增生、肺組織NE及MUC5AC mRNA表達、氣道上皮NE及MUC5AC蛋白表達升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，解毒清肺組氣道上皮黏液腺體增生顯著降低（P<0.01），且作用與克拉霉素組相當；解毒清肺組肺組織NE、MUC5AC mRNA表達顯著降低（P<0.01），且作用優于克拉霉素組；解毒清肺組氣道上皮MUC5AC蛋白表達降低（P<0.05），且作用與克拉霉素組相當。解毒清肺組和克拉霉素組氣道上皮NE蛋白表達與模型組無差異。結論 解毒清肺合劑通過NE下調MUC5AC蛋白表達，調節慢性阻塞性肺疾病氣道黏液高分泌。

關鍵詞：解毒清肺合劑；慢性阻塞性肺疾病；氣道黏液高分泌；彈性蛋白酶；黏蛋白5AC；大鼠

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）05-0073-05

Effects of Jiedu Qingfei Mixture on Expressions of NE and MUC5AC in Lung Tissue of Rats with Chronic Obstructive Pulmonary Disease CHEN Ying1， FENG Cui-ling1， LI Gen-mao2， GE Dong-yu2， WANG Jun1 （1. Dongzhimen Hosipital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China； 2. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract： Objective To explore the mechanism of Jiedu Qingfei Mixture for airway mucus hypersecretion of rat models with chronic obstructive pulmonary disease （COPD）. Methods Airway instilling lipopolysaccharide combining fuming method was used to establish COPD models. Forty clean level Wistar strain rats were randomly divided into blank control group， model group， Jiedu Qingfei group， and clarithromycin group. Model group， Jiedu Qingfei group， and clarithromycin group were given normal saline， Jiedu Qingfei Mixture， and clarithromycin by gavage respectively， while the blank control group was raised normally for 30 d. All rats were killed on the 31st day for taking lung tissue （6 rats from each group were chosen randomly）. Pathological changes of lung tissue and mucous glands hyperplasia were observed by HE staining method. NE and MUC5AC mRNA expression on lung tissue were detected by RT-PCR method. Protein expressions of NE and MUC5AC on pulmonary tissue and airway epithelium were detected by immunohistochemical method. Results Compared with blank control group， mucous glands hyperplasia on airway epithelium， mRNA expression of NE and MUC5AC in lung tissue， and protein expressions of NE and MUCA5C on airway epithelium in the model group significantly increased （P<0.05， P<0.01）. Compared with model group， mucous glands hyperplasia on airway epithelium in Jiedu Qingfei group significantly decreased （P<0.01）， as same as clarithromycin group； Jiedu Qingfei group showed better effects on down-regulating NE and

MUC5AC mRNA expression in lung tissue compared with clarithromycin group. MUC5AC protein expression on airway epithelium in Jiedu Qingfei group significantly decreased （P<0.05）， as same as clarithromycin group. Jiedu Qingfei group and clarithromycin group had no difference on NE protein expression in airway epithelium compared with model group. Conclusion Jiedu Qingfei group Mixture can reduce airway mucus hypersecretion of COPD by down-regulating MUC5AC expression through neutrophil elastase.

Key words： Jiedu Qingfei Mixture； chronic obstructive pulmonary disease； airway mucus hypersecretion； neutrophil elastase； MUC5AC； rats

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種嚴重危害人類健康的慢性呼吸系統疾病。以黏蛋白5AC（Mucin 5AC，MUC5AC）為主的氣道黏液高分泌被認為是影響COPD病情和預后的獨立危險因素[1]，氣道黏液高分泌的機制主要有病原相關分子模式、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、細胞因子[2]，而NE被認為是目前已知最強促黏液分泌劑[3]。COPD屬中醫學“肺脹”范疇，痰、熱、毒為慢性阻塞性肺疾病急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）主要病理因素[4]。前期研究表明，解毒清肺合劑可減少AECOPD模型大鼠氣道杯狀細胞的化生，減少氣道黏液高分泌[5]。為進一步探索其作用機理，我們以NE為觀察靶點，探索解毒清肺合劑調節COPD氣道黏液高分泌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

6～8周雄性清潔級Wistar大鼠，體質量（250±20）g，許可證號SCXK（京）2009-0007，北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養于北京中醫藥大學東直門醫院中醫內科學教育部重點實驗室動物房，SPF級常規飼養。

1.2 藥物

解毒清肺合劑（炙麻黃、炒苦杏仁、生石膏、炙甘草、桔梗、黃芩、牛蒡子、僵蠶、白花蛇舌草等），北京中醫藥大學東直門醫院院內制劑，批號11040101；克拉霉素片，麗珠集團制藥廠，批號120201，0.25 g/片。

1.3 主要試劑與儀器

脂多糖（LPS，美國Sigma公司），大前門牌香煙（上海卷煙廠），Trizol RNA提取試劑（Invitrogen公司），M-MLV反轉錄酶（Promega公司），SYBR GreenPCR Master Mix試劑盒（BIO-RAD公司），引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；一抗：NE（abcam，Ab21595，兔來源多克隆抗體），MUC5AC（abcam，Ab79082，鼠來源單克隆抗體），DAKO二抗，封閉液為10%山羊血清，阻斷劑：3%H2O2。實時熒光定量PCR儀（BIO-RAD公司），自制煙熏箱、氣管插管針（16號改良靜脈套管針）。

1.4 分組、造模及給藥

采用隨機數字表法將40只Wistar大鼠隨機分為空白對照組、模型組、解毒清肺組、克拉霉素組。解毒清肺合劑每日給藥量為2.16 g/kg，相當于人臨床用量的7倍。空白對照組正常飼養，其余3組分別給予生理鹽水、解毒清肺合劑、克拉霉素（83.3 mg/kg）灌胃，每日給藥量8 mL/kg，每日1次，連續30 d。采用氣道滴注LPS聯合煙熏方式，復制AECOPD氣道黏液高分泌模型[6]。LPS氣道滴注：于實驗第1、14日氣道內滴注濃度為1 mL/mg的LPS溶液0.2 mL。3.5%水合氯醛腹腔注射1 mL/100 mg麻醉大鼠，將麻醉大鼠仰臥位固定在鼠板上，頭高尾低呈45°角放置，暴露聲門，在光源下將套管針迅速插入大鼠氣管內，拔出套管針鋼芯，以棉絲放在塑料套管外口判斷是否成功，插管成功后，先抽取空氣0.3 mL后抽取LPS溶液0.2 mL，通過套管針快速注入氣管，然后將大鼠固定板直立旋轉，左右搖晃30次，使LPS溶液均勻分布于兩肺。煙熏：實驗第2～13、15～30日給予煙熏，每次10只大鼠，用8支香煙，30 min/d，氣道滴注日不煙熏。

1.5 標本制備

實驗第31日取材，腹主動脈放血處死動物，取右上葉肺組織，液氮保存，勻漿提取RNA；取右肺中葉，4%多聚甲醛溶液固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋及切片，厚度6 μm。實驗過程中各組均有死亡，每組隨機選取6只備檢。

1.6 指標檢測

1.6.1 HE染色 將肺組織切片經二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、蒸餾水、蘇木精染液、鹽酸乙醇溶液、清水、清水、氨水溶液、伊紅染液、蒸餾水、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ后入通風櫥封片。使用Image-Pro Plus 6.0軟件計算Reid指數（腺體厚度與支氣管厚度之比）。

1.6.2 RT-PCR檢測 前期研究表明，總RNA樣品經瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下觀察可見18 s、28 s兩條清晰的條帶，未被降解。紫外分光比色測定顯示，所有RNA樣品在260、280 nm處A值之比均在1.8～2.0之間，純度符合要求，各目標融解曲線均為單一峰，擴增曲線均呈平行分布[7]。總RNA提取，RT-PCR擴增，引物1 μL。MUC5AC上游5'-CTGTGTCCATCT CAACCTTA-3'，下游5'-GCTGCCATCTATCCAATCA-3'，產物長度101 bp；NE上游5'-AATGTGACAGTGG TGACTAA-3'，下游5'-GGCTGCGGATAATGGAAT-3'，產物長度232 bp；β-actin基因為內參，上游5'-CCC ATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游5'-TTTAATGTCA CGCACGATTTC-3'，產物長度150 bp。反應條件：94 ℃、10 min，55 ℃、10 s，72 ℃、10 s，共45個循環。CFX-96系統記錄PCR反應及數據采集。

1.6.3 免疫組化檢測 石蠟切片脫蠟至水，二甲苯（三缸8 min、8 min、8 min），梯度乙醇（無水、95%、75%）每缸5 min，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水沖洗1次。pH 6.0檸檬酸高溫高壓修復2 min，冷卻至室溫，轉入TBS中，沖洗3次，每次5 min。3%雙氧水室溫20 min，TBS沖洗3次，每次5 min。10%山羊血清孵育20 min。滴加一抗（NE濃度為1∶100，MUC5AC濃度為1∶50），4 ℃過夜。第2日從4 ℃冰箱取出，復溫15 min，TBS沖洗3次，每次5 min。每張切片滴加50 μL DAKO二抗，室溫孵育25 min，TBS沖洗3次，每次5 min。甩去TBS，每張切片滴加50 μL新鮮配置的DAB，鏡下觀察。自來水沖洗，蘇木素復染2 min，自來水沖洗。鹽酸乙醇分化1～2 s，自來水沖洗，溫水返藍。切片放置梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。應用Image-Pro Plus 6.0軟件讀取每個視野下陽性表達區域的平均光密度值。

1.7 統計學方法

采用SPSS17.0 統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，多組間均數比較采用方差分析，滿足方差齊性時組間比較采用LSD法，不滿足方差齊性時采用Tamhane's T2法進行兩兩比較。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 解毒清肺合劑對模型大鼠肺組織病理形態的影響

空白對照組大鼠氣道黏膜上皮完整，纖毛無粘連、倒伏及脫落，上皮細胞極少壞死脫落，極少有杯狀細胞，黏膜下腺體無增生、肥大；支氣管管壁無充血、水腫，無淋巴細胞及漿細胞浸潤，支氣管腔內無分泌物形成，管壁平滑肌束無斷裂、萎縮。模型組纖毛粘連、倒伏、脫落明顯，上皮細胞增生、增厚，明顯壞死脫落，杯狀細胞增生，黏膜下腺體肥大；支氣管壁及支氣管周圍淋巴細胞及漿細胞明顯聚集浸潤，管壁平滑肌束斷裂、萎縮；肺泡間隔明顯變薄并斷裂，相鄰肺泡廣泛融合形成較大囊腔，典型肺氣腫表現，肺間質充血明顯。解毒清肺組纖毛粘連、脫落，上皮細胞壞死脫落較模型組及克拉霉素組減輕；支氣管腔內可見少量淋巴細胞，杯狀細胞增生程度較輕，支氣管壁淋巴細胞浸潤，管壁平滑肌束萎縮；肺泡間隔明顯變薄、斷裂，支氣管周圍相鄰肺泡膈較多融合，肺間質淋巴細胞浸潤，充血較模型組減輕。克拉霉素組纖毛粘連、倒伏、脫落，上皮細胞存在壞死脫落較模型組減輕，杯狀細胞增生程度較模型組減輕；支氣管壁淋巴細胞浸潤，管壁平滑肌束萎縮；肺泡間隔明顯變薄、斷裂，支氣管周圍相鄰肺泡膈融合較模型組減輕，肺間質淋巴細胞浸潤，充血較模型組減輕。結果見圖1。

空白對照組 模型組

2.2 解毒清肺合劑對模型大鼠氣道上皮黏液腺體增生的影響

通過Reid指數評價黏液腺體增生。與空白對照組比較，模型組Reid值顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，解毒清肺組、克拉霉素組Reid值均顯著降低（P<0.01）；與克拉霉素組比較，解毒清肺組Reid值無明顯差異。結果見表1。

2.3 解毒清肺合劑對模型大鼠肺組織中性粒細胞彈性蛋白酶、黏蛋白5AC基因表達的影響

與空白對照組比較，模型組NE、MUC5A mRNA表達顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，解毒清肺組NE、MUC5AC mRNA表達顯著降低（P<0.01）；克拉霉素組NE、MUC5AC mRNA表達顯著降低（P<0.05）；與克拉霉素組比較，解毒清肺組NE、MUC5AC mRNA表達顯著降低（P<0.05）。結果見表2。

2.4 解毒清肺合劑對模型大鼠肺組織及氣道上皮中性粒細胞彈性蛋白酶蛋白表達的影響

肺組織輪廓清晰，其中棕黃色區域為陽性蛋白表達（見圖2），可見NE蛋白主要在肺組織小氣道。與空白對照組比較，模型組大鼠氣道上皮NE蛋白表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，解毒清肺組、克拉霉素組大鼠氣道上皮NE蛋白表達無明顯差異；與克拉霉素組比較，解毒清肺組大鼠氣道上皮NE蛋白表達無明顯差異。結果見表3。

2.5 解毒清肺合劑對模型大鼠肺組織及氣道上皮黏蛋白5AC蛋白表達的影響

肺組織輪廓清晰，其中棕黃色區域為陽性蛋白表達（見圖3），可見MUC5AC蛋白主要在肺組織小氣道。與空白對照組比較，模型組大鼠氣道上皮MUC5AC蛋白表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，解毒清肺組、克拉霉素組氣道上皮MUC5AC蛋白表達顯著降低（P<0.01）；與克拉霉素組比較，解毒清肺組氣道上皮MUC5AC蛋白表達無明顯差異。結果見表3。

3 討論

痰濁作為影響慢阻肺疾病發展進程的重要病理因素，貫穿COPD始終[8]。以往研究表明，痰熱壅肺證是AECOPD最主要的證候表現[9]，法隨證立，因此提出清熱、化痰、解毒法治療AECOPD。

解毒清肺合劑為北京中醫藥大學東直門醫董建華教授臨床經驗方清肺飲化裁而來，現為北京中醫藥大學東直門醫院院內制劑，主要用于治療風溫肺熱病痰熱壅肺證，療效顯著[10]。其在麻杏石甘湯基礎上，加黃芩、桔梗、牛蒡子、白花蛇舌草、白僵蠶等，具有清熱解毒、宣肺化痰功效。研究表明，該方能提高呼吸道病毒感染患者自然殺傷細胞活力、增加IL-2活性[11]，提高流感病毒A/PR/8/34（H1N1）感染小白鼠

血凝素抗體及神經氨酸酶抗體水平[12]，降低血漿內皮素[13]，提高巨噬細胞的吞噬功能[14]。方中麻黃味辛、微苦性溫，入肺、膀胱經，具有發汗解表，宣肺平喘之功效；苦杏仁，苦，微溫，歸肺、大腸經，具有止咳平喘功效；二者配伍一宣一降，共同調節肺之氣機，使痰濁易散。生石膏，辛，大寒，辛寒入肺經，善清肺經實熱，與麻杏相配，為治肺熱喘咳之常用配伍。黃芩，苦、寒，專入肺經，善清瀉肺火及上焦實熱，常用治肺熱壅遏所致咳嗽痰稠。桔梗，苦、辛、平，歸肺經，具有宣肺、祛痰、利咽、排膿功效。牛蒡子，辛、苦、寒，歸肺、胃經，具有疏散風熱、宣肺祛痰、利咽透疹、解毒消腫功效。白花蛇舌草，甘、寒，具有清熱解毒，利濕通淋功效。白僵蠶，咸、辛、平，具有化痰散結功效。縱觀全方，寒熱配伍得當，熱清使痰無助長之因，痰消使熱無生長之源，麻杏一宣一降，順應肺之宣發肅降的生理特性，使肺之氣機調暢，痰熱易消。

正常氣道黏膜表面覆蓋少許黏液（以MUC5AC為主），主要由氣道上皮杯狀細胞及黏膜下腺體分泌，在氣道固有免疫中起著重要作用，而過度分泌的氣道黏液則可引起肺功能及生活質量的下降、增加COPD急性加重的次數、頻繁的住院率及高死亡率[15]。

NE是中性粒細胞分泌的絲氨酸蛋白，廣泛存在于慢性氣道炎癥性疾病中。過多的NE可加重COPD炎癥反應，誘導上皮細胞凋亡，還可通過增加MUC5AC mRNA表達的穩定性、激活活性氧簇相關信號通路、杯狀細胞化生等多種途徑，使其成為MUC5AC高分泌的強烈刺激因子。

NE作為COPD氣道黏液高分泌的強烈刺激因子，可抑制NE活性能夠顯著減輕炎癥反應及MUC5AC基因及蛋白表達。本研究顯示，解毒清肺合劑可顯著減輕COPD模型大鼠黏液腺體增生、支氣管壁淋巴細胞浸潤、肺泡隔融合等COPD典型病理形態學改變。另外，解毒清肺合劑還可通過抑制肺組織NE mRNA表達，降低MUC5AC mRNA及蛋白的表達，表明解毒清肺合劑可抑制COPD模型大鼠氣道黏液高分泌。本研究顯示，解毒清肺組大鼠氣道上皮NE蛋白表達與模型組無差異。由于真核基因表達的轉錄和翻譯發生的時間和位點存在時空間隔；在基因轉錄后，還有轉錄后加工、轉錄產物的降解、翻譯、翻譯后加工、降解及修飾很多層面，檢測的時間點不同，均會使基因和蛋白水平出現不完全一致。另外，由于免疫組化在蛋白定量中檢測方法的局限性，均可解釋解毒清肺合劑在COPD模型大鼠NE基因及蛋白表達存在的差異性。

綜上所述，解毒清肺合劑可能通過NE下調氣道黏蛋白5AC表達，從而抑制COPD氣道黏液高分泌，具體作用機制有待進一步深入研究。

參考文獻：

[1] ROGERS D F. Physiology of airway mucus secretion and pathophysiology of hypersecretion[J]. Respir Care，2007，52（9）：1134-1146.

[2] 倪圣，丁建中.氣道黏液高分泌機制研究進展[J].長江大學學報（自然科學版），2013，10（9）：97-101.

[3] HAUBER H P， FOLEY S C， HAMID Q， et al. Mucin overproduction in chronic inflammatory lung disease[J]. Can Respir J，2006，13（6）：327-335.

[4] 孫雪松，許國磊.麻杏石甘湯加減治療慢性阻塞性肺疾病急性發作臨床觀察[J].世界中醫藥，2015，10（2）：199-205.

[5] 于會勇，王成祥，劉治坤，等.解毒清肺合劑對慢性阻塞性肺疾病急性加重期痰熱蘊肺證模型大鼠氣道杯狀細胞的影響[J].中國中醫藥信息志，2012，19（8）：31-33.

[6] 王駿，李春盈，劉治坤，等.慢性阻塞性肺疾病氣道黏液高分泌型大鼠模型的建立[J].心肺血管病雜志，2014，33（4）：592-595.

[7] 馮淬靈，司娜，王駿，等.清金化痰湯對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺組織中性粒細胞彈性蛋白酶及黏蛋白基因表達的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2015，22（5）：76-79.

[8] 王琦，武維屏，田秀英，等.肺脹病機及益氣活血化痰法的運用[J].中國醫藥學報，1995，10（3）：29-31.

[9] 王至婉，李建生，余學慶，等.COPD急性加重期基礎證及特征的臨床調查研究[J].北京中醫藥大學學報，2010，33（10）：703-708.

[10] 王成祥，杜懷棠.辨證治療老年風溫肺熱病55例[J].中國中醫急癥， 1992，1（1）：33-36.

[11] 歐敏，杜懷堂，姜良鐸，等.清肺飲對風溫肺熱病患者NK-IFN-IL-2的調節作用[J].海軍總醫院學報，2001，14（4）：231-233.

[12] 王成祥，王慧芳，沈杏生，等.清肺飲對流感病毒A/PR/8/34（H1N1）感染小白鼠血凝素抗體、神經氨酸酶抗體的影響[J].中國中藥雜志，2004， 29（2）：191-192.

[13] 歐敏，杜懷棠，段蘊鈾.清肺飲對小鼠呼吸道流感病毒感染血漿內皮素的影響[J].北京中醫藥大學學報，2003，26（4）：32-33.

[14] 王成祥，王惠芳，姜良鐸，等.清肺飲對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2003，10（10）：32-33.

[15] RAMOUS F L， KRAHNKE J S， KIM V. Clinical issues of mucus accumulation in COPD[J]. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis，2014， 9（1）：139-150.