高溫干旱復合脅迫對構樹幼苗抗氧化酶活性和活性氧代謝的影響

吳永波，葉　波

南京林業大學，江蘇省南方現代林業協同創新中心，南京　210037

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高溫干旱復合脅迫對構樹幼苗抗氧化酶活性和活性氧代謝的影響

吳永波*，葉波

南京林業大學，江蘇省南方現代林業協同創新中心，南京210037

摘要:近年來，全球氣溫不斷升高，亞熱帶部分地區夏季高溫和臨時性干旱現象日益顯著，高溫與干旱嚴重威脅著植物的生存與生長。采用盆栽和人工氣候室方式模擬不同的溫度和土壤水分梯度，研究了高溫與干旱復合脅迫對構樹幼苗超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)與過氧化氫酶(CAT)活性、活性氧代謝和丙二醛(MDA)含量的影響。結果表明:(1)高溫或干旱單一脅迫下，構樹幼苗SOD、POD、CAT活性增加，復合脅迫下，SOD和POD酶活性高于單一脅迫，且隨著復合脅迫時間延長而升高。SOD活性受溫度和土壤水分雙因素影響極其顯著，復合脅迫對SOD活性有一定程度的疊加效應;(2)復合脅迫下，活性氧代謝物與MDA含量均顯著高于單一脅迫，表明復合脅迫加劇對植物的傷害。通過改變抗氧化酶活性以減輕膜脂過氧化的傷害作用是有限的。

關鍵詞:高溫;干旱;抗氧化酶活性;活性氧代謝;構樹幼苗

吳永波，葉波.高溫干旱復合脅迫對構樹幼苗抗氧化酶活性和活性氧代謝的影響.生態學報，2016，36(2): 403-410.

Wu Y b，Ye B.Effects of combined elevated temperature and drought stress on anti-oxidative enzyme activities and reactive oxygen species metabolism of Broussonetia papyrifera seedlings.Acta Ecologica Sinica，2016，36(2): 403-410.

由于溫室氣體排放量增加等原因，預計到21世紀末全球氣溫將上升1.8—4.0℃［1］，部分區域出現明顯旱化，發生旱災頻率和嚴重性增加［2-3］。由于副熱帶高壓的影響，我國亞熱帶江淮、江漢、江南、華南北部、四川盆地東部、重慶等地常出現持續夏季高溫干旱天氣，這些地區日最高氣溫超過35℃的日數較多，部分地區極端最高氣溫甚至超過40℃，對農林業生產帶來嚴重的不利影響。作為全球氣候變化的兩個重要表征，高溫和干旱是決定植物分布最為重要的非生物因子［4］。必須同時考慮影響植物生長、發育和功能的溫度和水分兩個重要環境因子，才能正確推斷未來氣候條件下植物的生理生態過程。

活性氧(ROS)是植物代謝過程中的毒副產品，在穩定條件下，可以通過各種抗氧化防御機制清除。在干旱或高溫等逆境脅迫下，活性氧的過多積累導致生物膜脂過氧化等有害的細胞學效應，對植物產生傷害［5］。另一方面，植物體內存在抗氧化機制，可以在一定程度上減緩這種傷害。研究高溫與干旱復合脅迫對植物活性氧代謝及其抗氧化酶活性的影響，有利于揭示植物活性氧代謝機制對高溫與干旱的響應方式和程度。目前，干旱或高溫單一因子對木本植物的脅迫研究有大量報道，但不同研究，酶活性表現出增加或減少完全相反的變化規律［6-7］，表明植物適應逆境脅迫的復雜性，而關于干旱高溫復合脅迫對木本植物生理生態過程，尤其是抗氧化機制的影響研究較少［8］。

構樹(Broussonetia papyrifera)屬桑科(Moraceae)構樹屬(Broussonetia)，為速生落葉喬木，抗鹽堿，耐貧瘠，萌發能力強，廣泛分布于我國大部分地區［9］。其在高鹽地區以及丘陵、河灘等土地上均可正常生長，在荒山、石灰巖等劣質生境恢復中具有重要作用［10-11］。目前對構樹的研究則多集中在鹽分或水分等單一脅迫［12-14］。本文利用人工氣候室，研究高溫與干旱單一或復合脅迫下，構樹幼苗葉片抗氧化酶活性與活性氧含量變化的差異，以期為探討未來溫度增加和干旱情景下，構樹應對氣候變化的適應機理提供科學依據。

1材料與方法

1.1試驗材料與設計

2013年9月1日將健康狀況良好、長勢基本一致的1年生構樹幼苗(平均株高95 cm)定植在規格32 cm× 27 cm×28 cm的塑料盆中，每盆各1株幼苗。盆栽土為棕壤土，pH 6.5，硝態氮含量7.9 mg/kg，銨態氮含量12.6 mg/kg。在溫室生長2周后，9月開始在FYS-8智能人工氣候室(空氣相對濕度為60％;最大光合有效輻射為1800 μmol m－2s－1)中進行脅迫處理。試驗設3個水分梯度，分別為100％田間持水量、70％田間持水量、40％田間持水量。根據設定的土壤含水率計算每盆重量，作為標準盆重。以亞熱帶極端高溫40℃為上限，同時設置3個溫度處理，包括25、33、40℃，共9個處理，每個處理設置4個重復，共36盆。每天6: 00時，采用稱重法對整盆植物進行稱重補充水分，確保土壤含水率在控制條件下。同時模擬自然光照，調節光照量，于每天6: 00時打開光照、18: 00時關閉光照。

1.2測定指標與方法

自2013年9月15日起，每隔1周，選取1d在17: 00左右采取葉片進行抗氧化酶活性、活性氧含量及丙二醛含量測定，共采樣4次。取0.2g葉片洗凈后置于預冷的研缽中，加入1.6mL 50mmol/L預冷的磷酸緩沖液(pH7.8)在冰浴上研磨成勻漿，轉入離心管中在4℃、12000r/min下離心20min，取上清液測定酶活性和O－2含量，其中超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法［15］，過氧化酶(POD)活性采用愈創木酚顯色法［16］，過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法［16］，O－2含量參照王愛國和羅廣華方法［17］。取0.2g構樹葉片洗凈后置于研缽中，加入10ml冰丙酮研磨成勻漿，轉入離心管中在3000g下離心10min，取上清液測定H2O2含量，H2O2含量參照Liu等方法［18］。取0.2g構樹葉片洗凈后置于研缽中，加入1.6ml 10％TCA研磨成勻漿，轉入離心管中在12000r/min下離心10min，取上清液測定丙二醛含量，丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸法［19］。

1.3數據處理

用SPSS Stastics 20軟件對數據進行方差分析。

2結果分析

2.1不同處理對構樹幼苗抗氧化酶活性的影響

2.1.1對超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

干旱或高溫單一脅迫，均使SOD活性明顯增加(P＜0.05)。不同處理下，SOD活性最大值出現時間不同。受溫度單一脅迫和溫度與干旱復合脅迫時，SOD活性最大值出現在第21天，而受干旱單一脅迫時，SOD活性最大值出現在第14天。33℃和40％田間持水量處理下第21天的SOD活性增加幅度最大，達48.6％，33℃和100％田間持水量處理次之，達33.7％。

與33℃處理相比，40℃處理下的幼苗葉片SOD活性并未顯著升高(P＞0.05)。高溫和干旱復合脅迫下，構樹幼苗SOD活性高于單一脅迫，且隨著復合脅迫時間延續表現增加趨勢(圖1)。

圖1　不同處理下構樹幼苗SOD活性的動態變化Fig.1 Variation of superoxide dismutase activity in Broussonetia papyrifera seedling leaves under different treatments

2.1.2對過氧化物酶(POD)活性的影響

各處理間構樹幼苗POD活性變化趨勢不盡相同(圖2)。25℃下，隨著干旱脅迫時間持續，POD活性增加; 33℃處理下，40％田間持水量處理的POD活性呈先上升后下降的趨勢，100％和40％田間持水量處理的POD活性則呈現一直上升的趨勢; 40℃處理下，100％和70％田間持水量處理的POD活性呈先上升后下降的趨勢，而40％田間持水量處理下則表現為持續上升的趨勢。不同處理的POD活性在第14天或21天時達到最大，其中40℃和40％田間持水量處理的第21天POD活性最高，為81.39 U g－1min－1。結果表明，無論是單一脅迫還是復合脅迫，構樹幼苗受脅迫影響后POD活性均會顯著增加，且在復合脅迫下，POD活性顯著高于單一脅迫(P＜0.05)。

圖2　不同處理下構樹幼苗POD活性的動態變化Fig.2 Variation of peroxidase activity in Broussonetia papyrifera seedling leaves under different treatments

2.1.3對過氧化氫酶(CAT)活性的影響

圖3為不同溫度和干旱脅迫處理下構樹幼苗CAT活性隨處理時間持續的動態變化。由圖可知，在正常溫度和土壤水分條件下，構樹幼苗CAT活性無明顯變化。在40％田間持水量干旱脅迫時，40℃的CAT活性呈持續增加的趨勢，而33℃和25℃處理的CAT活性呈現先上升后下降的趨勢。在70％田間持水量干旱脅迫下，40℃和33℃處理的CAT活性先增加后下降，而25℃處理的CAT活性表現為持續增加的趨勢。總體而言，40℃處理下的CAT活性顯著高于25℃和33℃處理，復合脅迫下的CAT活性與單一脅迫相比差異不顯著(P＞0.05)。

2.2不同處理對構樹幼苗活性氧代謝的影響

2.2.1對H2O2含量的影響

各處理下，構樹H2O2含量變化總體上表現為隨著脅迫時間的延長而增加，在21d時其含量達到最大值(圖4)。干旱單一脅迫下，隨著干旱脅迫程度增加，H2O2含量增加。而在高溫單一脅迫下，H2O2含量大小表現為33℃＞40℃＞25℃，但增加程度不明顯。與33℃處理相比，40℃下H2O2含量略有所減少。復合脅迫下H2O2含量上升幅度均顯著高于單一脅迫(P＜0.05)。

2.2.2對O－2產生速率的影響

圖5為不同溫度和土壤水分處理下構樹幼苗O－2產生速率。由圖5可知，高溫單一脅迫下，O－2產生速率高于正常溫度的O－2產生速率。以第0d為例，33℃和40℃時O－2產生速率分別高于25℃的21.3％和78.9％。干旱單一脅迫下，O－2產生速率無明顯變化規律。隨著處理時間持續，33℃處理下，100％田間持水量處理的O－2產生速率先降低后上升，而40％和70％田間持水量處理的O－2產生速率則呈現先上升后下降再上升的趨勢。40℃處理下，100％和40％田間持水量處理的O－2產生速率變化趨勢與33℃處理下一致，而70％田間持水量處理的O－2產生速率則呈先上升后下降的趨勢。復合脅迫下O－2含量增加幅度均顯著高于單一脅迫(P＜0.05)

圖3　不同處理下構樹幼苗CAT活性的動態變化Fig.3 Variation of catalase activity in Broussonetia papyrifera seedling leaves under different treatments

圖4　不同處理下構樹幼苗H2O2含量的動態變化Fig.4 Variation of hydrogen peroxide content in Broussonetia papyrifera seedling leaves under different treatments

2.3不同處理對構樹幼苗膜脂過氧化程度的影響

MDA含量是反映膜傷害和細胞膜脂過氧化的重要指標［20］。圖6為不同溫度和土壤水分處理下構樹幼苗MDA含量動態變化。由圖可知，隨著干旱單一脅迫程度的增加和時間延續，構樹幼苗MDA含量呈現持續上升趨勢。高溫單一脅迫下MDA含量高于正常溫度下MDA含量。與單一脅迫相比，高溫和干旱復合脅迫下MDA含量的上升幅度小，復合脅迫對構樹幼苗MDA含量的影響不顯著(P＞0.05)。

圖5　不同處理下構樹幼苗O－2產生速率的動態變化Fig.5 Variation of superoxide radical production rate in Broussonetia papyrifera seedling leaves under different treatments

2.4不同處理下構樹幼苗抗氧化酶活性與活性氧代謝的方差分析

方差分析結果表明(表1)，SOD、POD、CAT活性、O－2產生速率和MDA受溫度影響極顯著，H2O2受溫度影響顯著，H2O2和MDA含量受土壤水分影響極顯著，SOD、POD和O－2產生速率受土壤水分影響顯著，SOD活性受溫度和土壤水分雙因素影響極顯著。

表1　不同處理下抗氧化酶活性與活性氧代謝的方差分析Table 1 Variance analysis on anti-oxidative enzymes activities and ROS metabolism under different treatments

3討論和結論

3.1高溫干旱復合脅迫對抗氧化酶活性的影響

SOD是植物活性氧代謝的關鍵酶，可能在保護系統中處于核心地位;而POD和CAT兩種酶反映了植物生理生化代謝及生長發育情況，也可作為植物抗性大小的標志之一［21］。逆境脅迫下，植物的SOD、POD和CAT活性均有一定的提高［22-23］。本文研究結果發現，盡管變化規律不同，但在高溫或干旱脅迫下，構樹幼苗SOD、POD、CAT活性均增加，這與時忠杰等［23］和周廣等［24］的研究結果一致。與25℃相比，33℃下構樹幼苗葉片的SOD、POD和CAT活性顯著提高，而在40℃下，SOD活性則增加不明顯，與周廣等［24］和彭輝［6］的研究結果一致，表明高溫影響植物抗氧化系統清除活性氧的能力，這可能是由于過度高溫脅迫下引發膜脂過氧化作用，破壞酶的活性中心、改變酶的結構或抑制酶的表達［25］。復合脅迫下，3種抗氧化酶活性均有不同程度的增加，且隨著脅迫時間持續和脅迫程度增加而升高。復合脅迫下，SOD活性高于單一脅迫，且受溫度和土壤水分雙因素影響極顯著，表現出復合脅迫對SOD活性具有一定程度的疊加效應，意味著在復合脅迫下，植物抗氧化系統受影響程度加劇。

圖6　不同處理下構樹幼苗MDA含量的動態變化Fig.6 Variation of Malondialdehyde content in Broussonetia papyrifera seedling leaves under different treatments

3.2高溫干旱復合脅迫對活性氧代謝的影響

O－、HO是植物代謝過程中產生的兩種活性氧，對細胞膜脂質具有較強的氧化傷害作用，進而產生

222MDA，且其含量能反映細胞膜脂質過氧化作用強弱和植物受傷害程度。高溫單一脅迫下，O－2產生速率與MDA含量顯著增加，干旱單一脅迫下，H2O2含量與MDA含量顯著增加，表明在受到溫度或土壤水分等不同因子脅迫時，植物體內產生不同的活性氧代謝物對植物細胞膜產生傷害。在高溫與干旱復合脅迫時，H2O2含量、O－2產生速率及MDA含量顯著提高，且復合脅迫下3個指標均顯著高于單一脅迫，說明復合脅迫加劇對植物的傷害，這與魯萍等［26］的研究結果一致。相比33℃，40℃下H2O2含量總體有所下降，這是由于H2O2的清除酶POD和CAT活性增加導致。SOD作為O－2的主要清除酶，O－2產生速率的變化規律受SOD活性的影響［22］。復合脅迫下，活性氧代謝物與MDA含量均顯著高于單一脅迫，表明復合脅迫加劇對植物的傷害，通過抗氧化酶活性改變以減輕膜脂過氧化的傷害作用是有限的。

本研究結果表明了高溫和干旱復合脅迫對植物的傷害高于單一脅迫，筆者研究發現，構樹幼苗在復合脅迫下，凈光合作用速率下降［27］亦佐證了這一事實。但不同抗氧化酶活性呈現不同的變化趨勢，這是因為不同植物抗氧化防御機制不同［28］，需要增加不同種類抗氧化酶活性的分析，以更加準確揭示干旱和高溫等逆境脅迫對植物抗氧化系統的影響。

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Effects of combined elevated temperature and drought stress on anti-oxidative enzyme activities and reactive oxygen species metabolism of Broussonetia papyrifera seedlings

WU Yongbo*，YE Bo
Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry in Southern China of Jiangsu Province，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China

Abstract:In recent years，under the global climate change scenario，the occurrence of seasonal high temperature and temporal drought phenomena has increased in some subtropical regions.Consequently，the survival and growth of plants are restrained under the combined stress of elevated temperature and drought.In the present study，a pot experiment was performed at the Xiashu Forest Station of Nanjing Forestry University in 2013.One-year-old Broussonetia papyrifera seedlings were grown in 27-cm pots with brown loam soil，using a completely randomized design with four replicates.Seedlings were initially grown in the field environment and then transferred to a controlled greenhouse with three elevatedtemperature and soil-moisture treatments，and the effects of combined elevated temperature and drought stress on antioxidative enzyme activities and reactive oxygen species(ROS)metabolism were measured in B.papyrifera seedling leaves.The results indicated that under either elevated temperature or drought stress，the superoxide dismutase(SOD)，peroxidase(POD)，and catalase(CAT)activities of seedlings increased with the increase of stress level.Under the combined elevated temperature and drought stress，the activities of SOD and POD were higher than those under single temperature or drought stress，and increased over stress exposure time.Significant variation was observed in SOD activity of the seedlings betweenbook=404,ebook=132combined stress treatments，revealing the synergistic effects of combined stress on SOD activities.Under the combined elevated temperature and drought stress，ROS，including O(－)2production rates and hydrogen peroxide(H2O2)and malondialdehyde(MDA)contents，were significantly higher than those under the single temperature or drought stress treatment，which suggests the limited role of antioxidant enzyme activities in alleviating the damage of the cell membrane of seedlings due to differences in ROS metabolite accumulation.

Key Words:elevated temperature; drought; anti-oxidative enzyme activities; ROS metabolism; Broussonetia papyrifera seedlings

*通訊作者

Corresponding author.E-mail: yongbowu0920@ 163.com

收稿日期:2014-09-20;

修訂日期:2015-06-08

基金項目:江蘇省自然科學基金項目(BK2012819);江蘇省高校自然科學研究重大項目(15KJA180003);江蘇省生物學優勢學科建設項目

DOI:10.5846/stxb201409201862