基于p21啟動子報告基因系統的構建及應用

李繼友（天津渤海職業技術學院，天津300400）

基于p21啟動子報告基因系統的構建及應用

李繼友
（天津渤海職業技術學院，天津300400）

本研究通過構建p21啟動子報告基因系統，進行篩選能夠上調p21表達的有效中藥制劑，最終闡明其基本抗腫瘤機理。

啟動子；報告基因系統；構建

p21基因是重要的腫瘤抑制基因p53的靶基因，在細胞受內外環境脅迫的情況下，轉錄因子p53蛋白表達量升高，p53可以調節大量蛋白的表達，從而使細胞周期阻滯在G1/S期。p21可以以p53依賴和非依賴的方式表達升高，p21可以結合細胞周期蛋白依賴性激酶CDK2和CDK4/6，抑制細胞周期進程。多種放療和化療藥物治療腫瘤的機制就是誘導腫瘤細胞內p21表達升高，進而抑制細胞增殖，從而抑制腫瘤生長。

中藥是我們國家的瑰寶，許多藥物已經被用于治療不同類型的腫瘤，取得了良好的效果。但是其治療腫瘤的機制不明，限制了其應用和發展。我們構建了p21啟動子報告基因系統，用于篩選能夠上調p21表達的有效中藥制劑，進而闡明其抗腫瘤機理。

1材料與方法

1.1主要試劑

DMEM培養基（Gibco公司），胎牛血清（Hy?clone公司），Lipofectamine 2000（Invitrogen公司），G418（Calbiochem公司），反轉錄試劑盒及熒光素酶單報告檢測系統試劑盒（Promega公司），PCR反應中的Premix ExTaq和DNA Marker（Takara公司）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養

本論文中所用到的細胞系包括人胚腎細胞系293和宮頸癌細胞HeLa均購于中國科學院上海細胞研究所細胞庫。細胞用含10%胎牛血清、100μ g/ mL鏈霉素的DMEM（Hyclone）培養基，于37℃、5% CO2培養箱中培養，采用含0.02%EDTA的胰酶消化細胞并進行傳代[1]。

1.2.2質粒構建

WWP-Luc-1由Vogelstein博士(Johns Hopkins University, Baltimore, MD)提供[2]，它包含有2.3kb的p21啟動子片段，利用HindIII單酶切后連入pGL3-Enhancer載體上。然后用BglII和XbaI將該載體上的p21啟動子和熒光素酶基因酶切后連接到pCI-neo載體上。純化后的得到pCI-p21-luc-neo用于轉染（如圖1）。

圖1 pCI-p21-luc-neo質粒圖譜

1.2.3細胞轉染及篩選

24孔板中每孔加入500μLDMEM培養基，接種5× 104個293細胞，于37℃、5%CO2培養箱中培養24h。采用Lipofectamine2000分別轉染pCI-p21-luc-neo，每孔加入100μL脂質體-質粒轉染混懸液（含質粒DNA 0.4μg，Lipofectamine 2000 1μL），繼續培養24h。然后胰酶消化，轉移至10cm培養皿中；每皿加入含0.5mg/ mLG418的DMEM培養基；繼續培養5d后，更換含G418的新鮮培養基繼續培養得到單克隆[2]。

1.2.4熒光素酶報告基因檢測

應用熒光素酶單報告檢測系統試劑盒來檢測。利用Turner Designs TD20/20光度計的單熒光素酶實驗系統模式來測定熒光素酶活性。用裂解液裂解細胞，加入熒光素酶的底物并檢測其活性。實驗結果均為3次獨立實驗結果的平均值。所有結果均以平均值±標準差(mean±SD)表示。

1.2.5總RNA提取及反轉錄PCR

利用Invitrogen公司的Trizol試劑提取總RNA，并利用Promega公司的反轉錄試劑盒進行反轉錄PCR，得到cDNA。

1.2.6 PCR及瓊脂糖凝膠電泳

以上述cDNA為模板，p21特異性引物（sense：5 ’- GGATGTCCGTCAGAACCC- 3’；antisense：5’-GCTCCCAGGCGAAGTCA-3’）和β-actin特異性引物（sense: 5’-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’；an?tisense：5’-ATGCCAGGGTACATGGTGGT-3’）進行PCR反應，反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

2實驗結果

2.1 p21啟動子報告基因系統的建立和鑒定：我們篩選到了穩定轉染p21啟動子的293細胞（293-p21），然后對該細胞進行鑒定。根據文獻報道，去乙?；敢种苿㏕SA，中藥甘草次酸均可以有效的誘導p21的表達。我們發現，用這兩種藥物處理293-p21細胞24h后，利用熒光素酶報告基因檢測，與對照相比，兩種藥物均可以顯著誘導p21的啟動子活性（圖2）。證明我們成功構建了藥物篩選的系統。

圖2

2.2篩選有效上調p21啟動子活性的中藥：我們利用構建的293-p21篩選系統，對多種可能具有抗腫瘤活性的中藥進行了檢測。我們用不同濃度的中藥處理細胞，24h后進行熒光素酶報告基因檢測，我們成功的檢測到中藥2號可以在低濃度的條件下顯著誘導p21的啟動子活性（圖3）。表明中藥2號可能通過上調p21水平發揮功能。

圖3

2.3陽性藥物上調p21 mRNA水平：為了進一步確定我們所篩選到的藥物可以上調p21水平，我們用中藥2號和TSA分別處理腫瘤細胞HeLa，24h后提取細胞的總mRNA進行反轉錄，利用得到的cDNA為模板，p21基因特異性引物進行擴增，我們發現和陽性對照藥物TSA一樣，中藥2號可以顯著上調腫瘤細胞中p21 mRNA的表達（圖4）。

圖4

3 討論

我們成功構建了一個基于p21基因啟動子的穩定轉染細胞系，由于p21是多種脅迫抑制細胞增殖的效應基因，很多的腫瘤藥物均可以誘導p21的表達。我們得到的系統經過驗證，可以有效地被已知的抗腫瘤藥物進行誘導，證實該系統可以作為篩選陽性藥物的有效工具。

中藥及中藥制劑已經被越來越多的用于各種疑難雜癥例如腫瘤的治療，并取得了良好的療效。但是在靶向治療、精準醫療的大環境下，由于其成分復雜，作用機制不清等原因，局限了中藥的應用。我們所得到的篩選系統可以有效的篩選通過p21途徑抑制細胞增殖的中藥，為進一步研究其作用機制奠定了基礎。

我們利用該篩選系統，成功的篩選到一個中藥可以有效的誘導p21啟動子活性，同時可以在mRNA水平誘導p21的表達，我們還將進一步對該藥物進行分離純化，得到更有效的單體成分，并用于腫瘤的治療。

［1］盧圣棟.現代分子生物學實驗技術（第二版）[M].北京：中國協和醫科大學出版社, 1999.

［2］J.薩姆布魯克,拉塞爾主編, D W,黃培堂等譯.分子克隆實驗指南第三版[M].北京：科學出版社, 2002.

10.3969/j.issn.1008-1267.2016.02.006

R730

A

1008-1267（2016）02-0017-03

2015-12-20

李繼友（1961－）男，副教授，高級工程師，主要從事化工專業教學與科研管理工作。