榆耳復合防腐劑的抑菌效果及作用方式

劉健美，么宏偉，吳洪軍，馮磊*

(1.黑龍江省林業科學院，哈爾濱150081；2.黑龍江省林副特產研究所)

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榆耳復合防腐劑的抑菌效果及作用方式

劉健美1，么宏偉2，吳洪軍2，馮磊1*

(1.黑龍江省林業科學院，哈爾濱150081；2.黑龍江省林副特產研究所)

摘要：為了明確黑木耳多糖和榆耳水提液的抑菌作用方式和機制，以及其與Nisin復合形成的天然生物防腐劑的抑菌作用效果和作用方式。采用雙層抑菌平板法，測出的抑菌圈根據Nisin的效價，分別計算出樣品對各種菌的效價。最小抑菌濃度(MIC)的測定，以不長菌的最低榆耳水提液及復配液濃度為對該菌的最小抑菌濃度。采用生長曲線法和瓊脂塊再培養法來測定榆耳水提液及天然防腐劑復配液的抑菌作用方式。結果表明，復合防腐劑對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等均有良好的抑菌效果。考察了生長過程中的活菌數，發現前6h活菌數顯著降低，從106 cfu/mL降低至102 cfu/mL，在12h以后含有20%的復配液的培養基幾乎沒有菌的生長，這說明復配液具有較強的殺菌作用。

關鍵詞：榆耳復合防腐劑；抑菌效果；作用方式

研究防腐劑抑菌物質的作用機制，對于評價該物質在食品中的應用前景有重要意義[1]。天然防腐劑抑菌或殺菌的作用機制比較復雜，包括干擾細胞質膜、破壞或損失細胞壁，致使胞內物質外泄，影響有關呼吸鏈電子傳遞系統，或影響DNA、RNA合成等，抑制酶活性，干擾正常代謝[2]。目前殼聚糖的抗菌機理目前已提出多種解釋，認為殼聚糖與細菌表面殘基相互作用，引起細胞滲透壓變化，抑制菌體正常生理代謝，導致細胞死亡。或是與DNA作用，抑制RNA和蛋白合成[3]。Nisin通過干擾細胞膜正常功能，造成物質泄漏、養分流失導致細菌死亡[4]。前期實驗已經證實了黑木耳多糖和榆耳水提液的抑菌效果，但其作用方式和機制還不清楚。因此與Nisin復合形成的天然生物防腐劑的抑菌作用效果和作用方式的闡明，對于后期復合防腐劑的應用具有重要的理論意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

金黃色葡萄球菌(Staphylociccusaureus)；大腸桿菌(Escherichiacoli)沙門氏菌(Salmonella)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)； 蠟樣芽孢桿菌 (Bacilluscereus)，均為黑龍江大學生命科學學院食品分析試驗室提供。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，牛肉膏蛋白胨液體培養基，雙層抑菌培養基(實驗室制備)。

1.2試驗方法

1.2.1天然防腐劑的制備。榆耳復配天然防腐劑(實驗室制備)： 4℃保藏備用。

1.2.2供試菌液的制備。保藏菌種接入牛肉膏蛋白胨液體培養基內(50/250mL的三角瓶)，置于恒溫搖床上活化培養，保持轉速在 150～160r/min，細菌在 37℃條件下培養 24h，傳代2次，進行試驗。

1.2.3抑菌試驗

1.2.3.1雙層抑菌平板法(杯碟法)。本試驗采用雙層抑菌平板法即杯碟法測定榆耳及榆耳復配液的抑菌活性。具體操作如下：取已滅菌的培養皿水平放置于超凈工作臺上，倒入適量已滅菌的下層培養基，輕轉培養皿使其均勻鋪平，待其凝固做為底層；取已滅菌的牛津杯(10 mm×8 mm×6mm)均勻放置其上(每皿不超過 6 支)，另取已滅菌的相應上層培養基5mL，冷卻至 50℃左右，將已培養至對數生長期的細菌培養液，菌濃度為106cfu/mL，按照細菌培養液：上層培養基為1∶5(體積比)的比例加入其中，迅速混勻，趁熱倒在底層培養基上，均勻攤布，靜止放于臺面上凝固后，依試驗要求在牛津杯中加入待測樣品0.1mL，做重復試驗。加好樣品后，靜止1～2min 后蓋上培養皿蓋，待上層培養基凝固后，將培養皿轉移至恒溫培養箱內培養(細菌37℃，24h)。上述過程嚴格要求無菌操作，并盡量保持培養基厚度一致，加菌量和待測樣品量相同且在操作中防止氣泡產生和樣品溢出。待菌苔長好后即可觀察抑菌圈，并記錄抑菌圈直徑以比較各樣品的抑菌活性。測出的抑菌圈根據Nisin的效價，分別計算出樣品對各種菌的效價。

1.2.3.2最小抑菌濃度(MIC)的測定。取子實體水提液與榆耳復配液加已滅菌的蒸餾水配制成一定梯度的稀釋液(水提液含量分別占 10%、15%、20%、25%、50%、80%、100%)。在對應的固體培養平板中分別添加不同濃度稀釋液各0.1mL，再分別添加各菌懸液0.2mL，均勻涂布滿整個平皿，蓋上皿蓋，待其稍干后倒置于適宜溫度的恒溫培養箱內培養(細菌37℃ 18h)，以不長菌的最低榆耳水提液及復配液濃度為對該菌的最小抑菌濃度。本次試驗利用平板計數法得出相對應菌的濃度約為106cfu/mL，試驗以0.1mL的蒸餾水(即0%水提液)為空白對照，Nisin為陽性對照。

1.2.4防腐劑對細菌的作用方式。本試驗采用生長曲線法和瓊脂塊再培養法來測定榆耳水提液及天然防腐劑復配液的抑菌作用方式。

1.2.4.1生長曲線法。定量稱取細菌培養基100 mL裝入三角瓶，吸取大腸桿菌5 mL培養過夜，分別將含榆耳水提液10%、20% 和復配液10%、20% 轉入上述三角瓶中，震蕩搖勻10min，混合均勻后，以無菌操作取5mL混合液分別加入標0、6、12、18、24、36、48h的7支試管中，并作空白對照，將試管置于搖床(250r/min)37℃ 震蕩培養，按相應時間放入冰箱中貯存，最后用平板活菌落計數法測定殘存的活菌數，以培養時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制大腸桿菌指示菌的生長曲線。

1.2.4.2瓊脂塊再培養法。將約為106cfu/mL的大腸桿菌菌懸液0.1mL涂布于含榆耳復合防腐劑的營養瓊脂平板上，置37℃下培養24h，以無菌操作切取經培養后未長菌的瓊脂塊，加到裝有LB培養液的三角瓶中，劇烈振蕩lh后，置37℃培養24h，平板菌落計數法檢測培養前后培養液中的活菌數。

2結果與分析

2.1榆耳復合天然防腐劑的抑菌活性

供試菌均為食品中常見引起食物腐敗的腐敗菌，因為以此為對象，具有一定的代表性。分別在各供試菌平板上牛津杯中加入復合防腐劑，100 μL/孔，以Nisin為陽性對照、無菌水為陰性對照。在適宜溫度下培養24h，測定抑菌圈直徑，結果如表1。

表1　榆耳防腐劑復配液對不同菌的效價

由表1可以看出，在添加很少量天然防腐劑的復配液抑菌效果很強，尤其是對金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的抑菌效果高達95 IU/mL，對大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的抑菌效果也提升至67 IU/mL以上。表明不同抑菌特性的抗菌物質復配的復合防腐劑具有協同作用，有效擴寬了抑菌譜，對多數革蘭氏陽性菌和陰性菌均有廣泛的抑菌效果。但對陽性菌的抑制效果強于陰性菌，這可能與革蘭氏陽性和陰性菌細胞壁結構有關。Nikaido等[5]研究表明，與革蘭氏陽性菌相比，革蘭氏陰性菌有獨特的外膜結構，對于抑菌物質具有一定的抵抗作用，而且不同種類的抑菌物質對不同細菌具有不同的抑菌作用。詳細機制還有待進一步研究。

2.2復合防腐劑的MIC

表2　榆耳復合天然防腐劑的MIC

注：—表示未見菌落生長；+ 表示有少量菌落生長；++ 為菌落較多但少于平皿面積 1/3；+++菌落達到平皿面積 1/2 及以上。

由表2觀察可知，復合防腐劑濃度在15%時，對大腸桿菌、沙門桿菌、和蠟樣芽孢桿菌菌落有少量的生長，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌并未長菌；然而當復合防腐劑濃度在20%時，所有菌本未見生長，表明復配液具有良好的抑菌活性，并得出復合防腐劑的MIC為20%。由此可見，復合防腐劑的濃度為20%時，能夠抑制所有細菌生長。

2.3榆耳復合天然防腐劑抑菌作用方式

防腐劑對微生物的作用方式有抑菌、殺菌或兼而有之。通過測定微生物生長狀況，可以評價不同抗菌物質對微生物作用的效果。通過不同培養時間取樣測定培養液中指示菌的吸光度和活菌數，可初步確定抗菌物質對指示菌的作用方式。

2.3.1榆耳復合防腐劑對指示菌生長曲線的影響。將含10%、20% 濃度的榆耳復合防腐劑與大腸桿菌在37 ℃下培養，在48h內定時取樣，測吸光度繪制生長曲線。如圖1可知，培養初期0～18h，在復合防腐劑的作用下，與正常相比，指示菌的菌數顯著降低，防腐劑抑菌情況下，菌體的吸光度值均在0.2以下，而且復合防腐劑濃度越高，菌數越少，說明防腐劑具有很強的抑菌能力。培養后期18～48h，含復配液的樣品OD值維持在0.2以下，可以看出添加天然防腐劑的復配液抑菌作用很穩定，而且18h之后，菌體OD值有逐漸下降的趨勢，表明菌落總數也在明顯減少，這說明復合防腐劑不僅有抑菌作用，而且還有一定的溶菌作用。

圖1　不同濃度榆耳水提液和防腐劑復配液對

圖2　不同濃度榆耳水提液和防腐劑復配液抑菌后的活菌數

分別將含10%、20% 濃度的榆耳復合防腐劑與大腸桿菌在37℃下培養，在48h內定時取樣，利用平板計數法測定活菌數，結果如圖2所示。

由圖2可知，在10%和20%復合防腐劑的作用下，6h內活菌數急劇下降，由106cfu/mL下降到102cfu/mL，而隨著時間的延長，大腸桿菌的活菌數還在明顯下降，在12h以后含有20%的復配液的培養基幾乎沒有菌的生長，這說明復配液具有較強的殺菌作用。

2.3.2榆耳復合防腐劑的作用方式。通過測定活菌數，結果含有復合防腐劑的平板上含有74 cfu/mL，將未長菌的瓊脂塊加入液體LB培養基，震蕩1h之后轉接到平板，培養24h后，活菌數增加到2.8×104cfu/mL。說明經過一定時間培養后，未長菌的瓊脂塊仍有活菌殘留，這部分菌應該是受到抑制。所以榆耳復合天然防腐劑對細菌的作用方式為抑菌和殺菌共有。

3結論

采用杯碟法、生長曲線法及瓊脂塊再培養法，研究了復合防腐劑的抑菌效果及對細菌的作用方式。結果表明，復合防腐劑對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等均有良好的抑菌效果。隨著防腐劑的濃度增加，對各供試菌的抗菌活性也顯著增強，但不同供試菌對復合防腐劑的抗菌作用敏感性不一致。以大腸桿菌為指示菌，顯示復合防腐劑的MIC為20%。生長曲線實驗結果表明，復合防腐劑顯著抑制指示菌的生長繁殖，具有較強的抑菌作用，在后期供試菌OD降低，表明防腐劑除了抑菌作用，還有一定的溶菌作用。進一步考察了生長過程中的活菌數，發現前6h活菌數顯著降低，從106降低至102cfu/mL，在12h以后含有20%的復配液的培養基幾乎沒有菌的生長，這說明復配液具有較強的殺菌作用。采用瓊脂塊再培養法進一步研究防腐劑的作用方式，發現經過一定時間培養后，未長菌的瓊脂塊仍有活菌殘留，這部分菌應該是受到抑制。所以榆耳復合天然防腐劑對細菌的作用方式為抑菌和殺菌共有。

參考文獻

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[2]Kanatt S R, Chander R, Sharma A. Chitosan glucose complex-A novel food preservative[J]. Food Chemistry, 2008, 106(2): 521-528.

[3]趙希榮,夏文水. 殼聚糖的抗菌防腐活性及其在食品保藏中的應用[J]. 食品研究與開發,2006(2):157-160.

[4]王麗，張毓，陳翠嵐.我國食品防腐劑的應用及發展趨勢[J].食品安全質量檢測學報,2011(2):83-87.

[5]Nikaido H.Multidrug efflux pumps of gram-negative bacteria[J].Journal of bacteriology,1996,178(20):5853.

中圖分類號:TS202.3

文獻標識碼:A

*通訊作者：馮磊(1981—)，男，副研究員，從事非木質林產品加工、保藏方面研究，E-mail: lkykjc@126.com。

基金項目：黑龍江省森林工業總局重點科研攻關項目(sgzjY2012008)；黑龍江省省屬科研院所基本科研業務費專項

收稿日期：2015-11-03

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.02.008