UPLC-MS/MS法測定動物源性食品中硝基呋喃代謝物殘留量

◎廖妍儼，龍四紅，孫 棣，陳 洪

（1.貴州省產品質量監督檢驗院，貴州 貴陽 550016；2.貴陽市疾病預防控制中心，貴州 貴陽 550002）

硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，對大多數真菌和原蟲等病原體具有殺滅作用。此類藥物主要作用于微生物酶系統，抑制微生物體內乙酰輔酶A的生成、干擾其糖類的合成代謝，從而起到抑制病原菌生長的作用[1]。研究表明，硝基呋喃類藥物在動物體內迅速分解產生代謝物，在弱酸性條件下，這些結合態代謝物可從蛋白質中釋放出來，對人體造成危害[2,3]。因此，通過檢測動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物，能起到對此類藥物使用情況的監控作用。

目前國內外對于硝基呋喃代謝物類藥物及其代謝物的檢測方法主要有高效液相色譜法[4]、酶聯免疫法[5]和液相色譜-串聯質譜法等，使用最多的是液相色譜-質譜聯用法。本研究旨在建立動物源性食品中4種硝基呋喃代謝物的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，并對樣品前處理方法、色譜條件、質譜條件等進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純、MERCK）；甲酸、冰醋酸（色譜純、Fisher Chemicals）；2-硝基苯甲醛（2-NBA、梯希愛）；二甲亞砜（DMSO、慧穎生物科技有限公司）；鹽酸（重慶川東化工集團有限公司）；乙酸銨（天津市科密歐化學試劑有限公司）；乙酸乙酯（上海申博化工有限公司）；磷酸氫二鉀（成都金山化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

ACCELA液 相 色 譜 儀（ 美 國 Thermo）；TSQ QUANTUM ULTRA質譜儀（美國Thermo)；自動恒溫震蕩器（昆山市儀器有限公司）；固相萃取裝置W-SPE 24（萊伯泰科儀股份有限公司）；Allegra X-22系列多功能臺式高速離心機（美國貝克曼庫爾特公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜和質譜條件

Thermo Aquasil C18色譜柱（150 mm×2.1 mm×1.7μm）；流動相A為含0.1%甲酸的乙腈，B為含0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～2 min，7%A；2.1～7 min，7%～85%A；7.1～10 min，7%A；流速：300μL/min；進樣量：10μL；柱溫：常溫。

采用電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；掃描模式：選擇反應監測模式（SRM）；噴霧電壓（IS）：3 000 V；離子源溫度：350 ℃；離子傳輸毛細管溫度：250 ℃；鞘氣壓力40 Arb，輔助氣流量10 Arb。

1.3.2 樣品前處理方法

精確稱取待測樣品2.00 g于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇∶水混合溶液（2∶1，V/V），均質器12 000 r/min均質1 min，棄去上清液。再向離心管中加入5 ng混合內標標準溶液，使4種硝基呋喃代謝物內標物最終測定濃度為2.0 ng/mL。樣品溶液中加入10 mL 0.2 mol/L HCl，再加入200 μL衍生化試劑2-硝基苯甲醛（2-NBA）溶液，置于37 ℃恒溫水浴中振蕩16 h。樣品溶液取出后靜置至室溫，加入5 mL 0.1 mol/L磷酸氫二鉀溶液，經離心機8 000 r/min離心5 min后，濾紙過濾，取濾液過固相萃取柱（HLB），樣品溶液全部通過固相萃取柱后用10 mL水洗滌，用5 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于50 ℃下用氮氣吹干，用10%的乙腈溶液溶解并定容至1.0 mL，混勻后過0.2 μm有機相濾膜，待測。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的優化

國家標準中的方法直接用離心后的上清液過HLB小柱，因樣品勻漿均質后成為漿狀，易在過柱時堵塞固相萃取小柱，且目標物不宜洗脫，操作繁瑣，導致樣品回收率降低。因此本實驗增加了濾紙過濾步驟，將全部衍生液過濾后再上柱，減少了過柱時間，提高了回收率。

2.2 質譜條件的優化

針對畜禽肉樣品基質復雜的特性，本實驗采用選擇反應監測模式（SRM）進行掃描，其原理是針對二級質譜或多級質譜的某兩級之間，即母離子選一個離子碰撞后，從形成的子離子中也只選一個離子。因為兩次都只選單個離子，所以樣品中的噪音和干擾被排除得更多，有效提高方法的靈敏度和重現性。

2.3 線性范圍和檢出限

對4種硝基呋喃代謝物標準樣品進行檢測，線性范圍和檢出限見表1。

表1 線性范圍和檢出限表

2.4 樣品的測定

采用上述方法對購自超市和農貿市場的16份樣品（豬肉和雞肉各8份）進行檢測，結果顯示有一個批次的豬肉檢測到有呋喃西林代謝物（SEM）存在，含量為4.7 μg/kg，其余樣品均未檢出硝基呋喃類代謝物。該方法穩定性強、靈敏度高、重現性好，適用于對動物源性食品中4種硝基呋喃類藥物代謝物殘留的同時檢測。

參考文獻：

[1]潘心紅，羅曉燕，李軍濤，等.直接測定蝦類硝基呋哺類殘留量方法的探討[J].中國衛生檢驗雜志，2010（4）：740-741.

[2]孫言春，張 潔，牟振波，等.固相萃取液相色譜串聯質譜測定水產品中硝基呋喃類代謝物殘留研究[J].中國漁業質量與標準，2011（2）：54-59.

[3]戴 欣，李改娟.水產品中硝基呋哺類藥物殘留的危害、影響以及控制措施[J].吉林水利，2011（9）：61-62.

[4]宋 凱，肖桂英，姜 橋，等.高效液相色譜法同步測定飼料及獸藥中4種硝基呋喃類藥物[J].糧食與飼料工業，2010（3）：49-51.

[5]沈美芳，宋紅波，耿雪冰，等.酶聯免疫法測定水產品中呋喃唑酮代謝物AOZ的殘留[J].水產學報，2006（4）：520-524.