響應面法優化懷山藥水溶性蛋白提取工藝的研究

◎付琴琴

（晉中市糧油檢測中心，山西 晉中 030600）

山藥為薯蕷科薯蕷屬植物薯蕷塊莖，為藥食同源保健食品，具有降血糖血脂、抗腫瘤、抗突變、抗氧化、免疫調節等功能[1]。學者們對本土山藥研究較多，如蛋白體內和體外抗氧化活性[2]、免疫調節活性及對血管緊張素轉化酶的非競爭性抑制作用[3]。國內學者研究主要集中于山藥種植技術、多糖提取及活性及深加工[4]等領域。本實驗以懷山藥（Dioscorea opposita polysaccharide，DOPS）為原料，研究其水溶性蛋白質的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

懷山藥，產自河南溫縣；濃硫酸、氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為分析純。

SPD80型凱氏定氮儀，北京三品科創儀器有限公司；DS-1型高速組織搗碎機，上海雙旭電子有限公司；DZKW-4型水浴鍋，北京中興偉業儀器有限公司。

1.2 測定方法

蛋白含量的測定均采用凱氏定氮法。

蛋白提取率=（提取液中蛋白濃度/山藥汁中蛋白濃度）×100%。

1.3 實驗方法

1.3.1 山藥汁樣品制取和山藥蛋白提取

懷山藥表面清洗擦凈，去皮，均漿，得到山藥汁樣品。取上述樣品10 mL于三角瓶，按一定水料比加入蒸餾水，一定溫度下提取一定時間，4 000 r/min離心10 min，取上清液。分別取10 mL山藥汁樣品和10 mL提取液進行凱式定氮試驗。

1.3.2 蛋白質含量的測定

蛋白含量[4]（g/mL）

式（1）中，V：消耗HCl，mL；V0：空白實驗時消耗的HCl，mL；N：HCl當量濃度；A：固定系數，6.25；W：樣品體積，mL。

2 結果與分析

2.1 山藥汁樣品蛋白含量測定結果

測定V為0.53 mL，V0為0.1 mL，N 為 0.01 mol/L。帶入公式（1）得山藥汁中蛋白質含量為0.376 mg/mL。

2.2 單因素試驗

2.2.1 水料比選擇試驗

提取溫度55 ℃，提取時間60 min，水料比分別2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1和12∶1，提取1次，比較水料比對提取效果影響，結果如圖1所示。

由圖1可知水料比增大蛋白提取率也增大，水料比增至8∶1后提取率減小。水料比過低，水分加入量少，混合液黏度較高，蛋白不易析出。水料比過高，加水量多給后續濃縮增加工作量，確定水料比8∶1。

圖1 水料比對提取效果影響圖

2.2.2 提取溫度的選擇試驗

水料比6∶1，提取時間60 min，提取溫度分別為15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃和55℃，提取1次，考察提取溫度對提取效果影響，結果如圖2所示。

由圖2可知，隨提取溫度提高蛋白提取率增大，達到35 ℃以后，提取率迅速減小。低溫條件下，蛋白質不能充分溶于水，提取不充分；溫度升高，蛋白與水作用加強，提取率可能升高；溫度過高，蛋白結構解體，蛋白分子變性凝固沉淀，確定提取溫度35 ℃。

圖2 提取溫度對提取效果影響圖

2.2.3 提取時間的選擇試驗

水料比6∶1，提取溫度55 ℃，依次提取30、60、90、120min和150min，提取1次，考察提取時間對提取效果影響，結果如圖3所示。

由圖3可知蛋白析出量最初隨時間增加上升，60 min后開始下降，下降幅度趨于平緩，表明開始時，蛋白析出速率快，之后降低可能與多糖、多酚等結合的蛋白還未析出；延長提取時間，細胞充分溶脹，蛋白質易溶出；時間過長，蛋白顆粒間作用力增強，易變性凝集沉淀。確定提取時間為60 min。

圖3 提取時間對提取效果影響圖

2.2.4 提取次數的選擇試驗

水料比1∶6，提取溫度55 ℃，提取時間60 min，依次提取1、2、3、4和5次，考察提取次數對提取效果影響，結果如圖4所示。

由圖4可知，提取1次蛋白提取率最高，隨著提取次數增加，提取率急劇下降，以提取1次為宜。

圖4 提取次數對提取效果影響圖

2.3 響應面分析及提取工藝優化

2.3.1 數學模型建立與檢驗

根據單因素試驗結果，提取1次蛋白提取率最高，選擇水料比、提取溫度和提取時間3個因素，利用Design-Expert 7.1.6軟件中心組合設計選項，共有17個試驗點，響應面分析因素和水平見表1。

表1 響應面因素水平表

對17個試驗點的結果統計分析，得到二次回歸方程：

各變量對響應值影響顯著程度由F檢驗判定，P值越小，顯著程度越高[5]。該試驗模型方程F值13.03，P＜0.05，整體模型顯著，失擬項不顯著，說明該回歸模型可靠，與實測值擬合良好，可用于蛋白提取條件分析和預測。

2.3.2 各因素影響程度分析

F值大小可判定各因素對蛋白提取率影響程度。F值越大對指標影響越強[6]。對個因素進行回歸方程方差分析，結果見表2。表2中，FXl=55.93，FX2=4.94，FX3=2.61，各因素影響程度順序為：水料比＞提取溫度＞提取時間。方程一次項X1回歸系數極顯著，說明水料比對蛋白提取率有極顯著影響；交互項中的X1X3項表現出了高度顯著水平，說明水料比和提取時間的交互作用對提取率有顯著影響。

表2 回歸方程方差分析表

2.3.3 響應面分析

響應面圖能直觀反映各因素對響應值影響及交互作用程度[7]。為考察交互作用對蛋白提取率影響，對模型降維分析。經Design-Expert 7.1.6軟件分析，可得到二次方程響應曲面圖，如圖5、圖6、圖7所示。

由圖5-7可知，在所選試驗范圍內，各因素均有極點；曲面陡峭程度可看出水料比影響最大，提取溫度次之，提取時間影響最小；等高線圖近似橢圓形，說明因素間有一定交互作用，結果與回歸分析吻合[8]。

圖 5 Y=f（X1，X2）的響應面

圖 6 Y=f（X2，X3）的響應面

圖 7 Y=f（X1，X3）的響應面

2.3.4 模型驗證

為驗證響應面法的可靠性，采用最優條件試驗，水料比8.25∶1，提取溫度35.18 ℃，提取時間60.26 min，提取次數1次，試驗重復3次，實際測得蛋白含量0.244 mg/mL，蛋白提取率64.9%，理論預測值0.253 mg/mL，蛋白提取率65.4%，相對誤差為－0.7%。

3 結論

懷山藥水溶性蛋白提取單因素試驗和響應面試驗確定最佳工藝條件為水液料比8.25∶1，提取溫度35.18 ℃，提取時間60.26 min，提取次數1次，蛋白質提取率可達到64.9%。

參考文獻：

[1]袁書林.山藥的化學成分和生物活性作用研究進展[J].食品研究與開發，2008，29（3）：176-179.

[2]孫芝楊，楊振東，焦宇知.淮山藥蛋白質的提取及抗氧化作用的研究[J].食品科技，2013，38（10）：232-235.

[3]HSU F L， LIN Y H，Lee Meihsien，et al.Both dioscorin， the tuber storage protein of yam （Dioscorea alata Tainong No.1）， and its peptic hydrolysates exhibited angiotensin converting enzyme inhibitory activities[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（21）：6109-6113.

[4]李月仙，黃東益，黃小龍，等.山藥的研究進展[J].中國農學通報，2009，25（9）：91-96.

[5]王岸娜，劉小彥，吳立根，等.獼猴桃蛋白質的分離及類型鑒定[J].河南工業大學學報，2009，30（8）：25-29.

[6]趙 翔，陸啟玉，章邵兵，等.水劑法同時提取花生油和蛋白質的工藝研究[J].農業機械，2012（12）：35-37.

[7]馮 晞，諸愛士，劉珊珊.響應面法優化大黃米多糖提取工藝[J].糧食與油脂，2016，29（3）：57-60.

[8]王若蘭，趙海波.響應面優化燕麥中抗氧化物質的提取工藝[J].糧食與油脂，2016，29（1）：41-44.